響應(yīng)面-滿意度函數(shù)優(yōu)化重組大腸桿菌產(chǎn)NMN轉(zhuǎn)移酶發(fā)酵條件

段琳琳， 李紅梅， 何 海

上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 楊浦 200093

響應(yīng)面-滿意度函數(shù)優(yōu)化重組大腸桿菌產(chǎn)NMN
轉(zhuǎn)移酶發(fā)酵條件

段琳琳， 李紅梅*， 何 海

上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 楊浦 200093

重組大腸桿菌Escherichaiacoli能高效表達(dá)NMN轉(zhuǎn)移酶, 以此為出發(fā)菌株，以菌體生長(zhǎng)量OD600和NMN轉(zhuǎn)移酶的活力為響應(yīng)值，對(duì)重組大腸桿菌產(chǎn)NMN轉(zhuǎn)移酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。首先以Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化篩選出3個(gè)主要影響因子：胰蛋白胨、甘油、MgSO4；隨后以Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)建立上述3個(gè)因子對(duì)OD600和NMN轉(zhuǎn)移酶活力水平的數(shù)學(xué)模型；最后通過(guò)滿意度函數(shù)獲得最佳發(fā)酵條件為：酵母粉30 g/L，胰蛋白胨10.5 g/L，甘油3.49 mL/L，MgSO40.45 g/L，K2HPO440.5 g/L，KH2PO46.0 g/L，NH4Cl 1.5 g/L，NaCl 0.6 g/L，接種量1.5%，誘導(dǎo)時(shí)間12 h。在該優(yōu)化條件下，菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶水平均獲得了顯著的提升。重組NMN轉(zhuǎn)移酶的活力水平從8.85 U/mg提高到15.48 U/mg，菌體生長(zhǎng)量OD600從4.85提高到6.01，提高幅度分別為74.92%和23.92%。

NMN轉(zhuǎn)移酶； 發(fā)酵優(yōu)化； 滿意度函數(shù)； 響應(yīng)面法

NMN轉(zhuǎn)移酶(Nmnat)作為生物體內(nèi)唯一一種能催化合成NAD的生物酶，對(duì)于維持體內(nèi)NAD水平至關(guān)重要[1]。研究發(fā)現(xiàn)在生物體內(nèi)適量的表達(dá)Nmnat也可以使非本體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)固，從而減少蛋白質(zhì)聚合和損傷，并且可以清理毒性蛋白以減少蛋白質(zhì)水解應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。作為生物體內(nèi)重要的“管家酶”，NMN轉(zhuǎn)移酶在糖代謝、基因調(diào)控和腫瘤細(xì)胞治療方面起到重要作用[2-3]。例如Nagase研究發(fā)現(xiàn)人類大腦中的Nmnat可延緩海馬組織中與學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)功能的衰退[4]。Nmnat還能使抗腫瘤藥物6-巰基嘌呤在生物體內(nèi)轉(zhuǎn)化為ATP類似物，從而抑制NAD的合成，使細(xì)胞內(nèi)NAD衰竭，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡[5]。

本課題組已成功構(gòu)建出產(chǎn)NMN轉(zhuǎn)移酶的重組大腸桿菌，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)及熱穩(wěn)定性進(jìn)行了系統(tǒng)研究。為提高該工程菌的產(chǎn)酶水平，對(duì)該菌的培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。目前，響應(yīng)面分析法是一種常見(jiàn)的培養(yǎng)基優(yōu)化方法，它可以將體系目標(biāo)響應(yīng)值作為一個(gè)或多個(gè)因子的函數(shù)，精確研究因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系，從而確定多因子系統(tǒng)的最優(yōu)發(fā)酵條件[6-7]。然而響應(yīng)面法在多響應(yīng)值優(yōu)化中存在一定的局限性，難以尋求各響應(yīng)值之間的均衡。為了合理、客觀的進(jìn)行多響應(yīng)值之間的分析評(píng)價(jià)，Derringer等提出滿意度函數(shù)法[8]，即通過(guò)特定的滿意度函數(shù)將各響應(yīng)值轉(zhuǎn)化為0到1之間的數(shù)，實(shí)現(xiàn)多響應(yīng)值向單響應(yīng)值的轉(zhuǎn)化，可以使各個(gè)響應(yīng)值保持均衡并在某種意義上達(dá)到總體最優(yōu)[9-10]。目前，響應(yīng)面結(jié)合滿意度函數(shù)法在微生物產(chǎn)酶條件優(yōu)化的應(yīng)用還較為少見(jiàn)。本研究采用響應(yīng)面法結(jié)合滿意度函數(shù)優(yōu)化重組大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)NMN轉(zhuǎn)移酶條件，旨在尋求菌體量與產(chǎn)酶能力的最佳組合，為后續(xù)的發(fā)酵放大試驗(yàn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌E.coliBL21(DE3)由實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒載體pET30α(+)購(gòu)自TaKaRa公司。E.coliBL21(DE3)pET30α(+)-Nmnat重組大腸桿菌由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購(gòu)自上海生工生物工程公司。酵母粉購(gòu)自湖北安琪酵母股份有限公司。蛋白胨購(gòu)自上海緣肽生物技術(shù)有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基采用 LB 培養(yǎng)基(g/L): 胰蛋白胨 10.0，酵母膏 5.0，NaCl 10.0。

磷酸鹽緩沖溶液(g/L): KH2PO423.1 g，K2HPO4125.4 g，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基采用TB培養(yǎng)基:胰蛋白胨12 g/L，酵母粉24 g/L，甘油4 mL/L，121 ℃滅菌20 min，待冷卻至60 ℃后按體積比9∶1加入上述磷酸鹽緩沖溶液。

固體培養(yǎng)基中瓊脂添加量2%。培養(yǎng)基中均需添加終濃度為30 μg/mL的硫酸卡那霉素。

1.2 方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

將確定重組成功表達(dá)的陽(yáng)性單菌落pET30α(+)-Nmnat的單菌落接種于10 mL滅菌后的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)(8 h～12 h)，即為種子液。

1.2.2 發(fā)酵及產(chǎn)酶方法

種子液以1%接種量接入含卡那霉素抗性的100 mL TB液體培養(yǎng)基，當(dāng)培養(yǎng)至OD600為0.5～0.7時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.4 mmol/L，25 ℃，180 r/min誘導(dǎo)表達(dá)一定時(shí)間后，離心收集菌體。離心后的菌體用50 mmol/L 的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.5)重懸，超聲破碎菌體(功率300 W，超聲4 s，間隔6 s，超聲60次)。破壁后菌液于4 ℃，12 000 r/min離心20 min，收集上清液備用。

1.2.3 NMN轉(zhuǎn)移酶活力的測(cè)定

反應(yīng)體系: 1 mol/L pH 7.5 Tris-HCl緩沖液，300 mmol/L NMN，50 mmol/L ATP，50 mmol/L Mn2+，乙醇2%，一定量的粗酶液，7U的ADH(乙醇脫氫酶)，混勻。置37 ℃恒溫水浴中振蕩反應(yīng)2 h，加入0.155 mol/L的EDTA反應(yīng)5 min，終止酶反應(yīng)，反應(yīng)液冰浴冷卻，8 000 r/min離心1 min，取上清液并在340 nm處測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的吸光值OD340，計(jì)算Nmnat活力。酶活力計(jì)算公式如下：

(公式1)

其中，EW為OD340，V為反應(yīng)體系的體積，mL;l為光程的距離，cm；蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用Bradford法。

酶活定義為：在37 ℃，1 mL反應(yīng)體系中，每分鐘催化得到1 μmol NMN的酶量為1 U。

1.2.4 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

當(dāng)影響因素較多時(shí)通常選用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選顯著因子[11]。選取酵母粉、胰蛋白胨、甘油、MgSO4、NH4Cl、NaCl、KH2PO4、K2HPO4、接種量、誘導(dǎo)時(shí)間作為PB設(shè)計(jì)的10個(gè)因素，每因素取2水平，高水平為低水平的1.5倍。為減少實(shí)驗(yàn)誤差，等間距引進(jìn)3個(gè)虛擬因子，分別為X4、X8、X12。通過(guò)比較各因素的顯著水平，篩選出對(duì)菌體的生長(zhǎng)量和酶活力影響顯著的因子，采用Minitab 15.0設(shè)計(jì)PB試驗(yàn)序，進(jìn)行試驗(yàn)分析，各因素及水平值見(jiàn)表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.5 最陡爬坡法的試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別以菌體生長(zhǎng)量OD600和Nmnat活力為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)爬坡試驗(yàn)的方向和梯度，以確定響應(yīng)面設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)[12]。

1.2.6 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以篩選出的3個(gè)因子進(jìn)行優(yōu)化處理，以最陡爬坡試驗(yàn)中最大響應(yīng)值所對(duì)應(yīng)的各因素值為響應(yīng)面設(shè)計(jì)中心點(diǎn)，用Design Expert 8.0進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析，具體見(jiàn)下表2。

1.2.7 滿意度函數(shù)

發(fā)酵過(guò)程中，微生物菌體量的增長(zhǎng)和產(chǎn)酶水平提高之間不一定呈線性關(guān)系，故采用滿意度函數(shù)法將多個(gè)響應(yīng)值轉(zhuǎn)化成單響應(yīng)值優(yōu)化，以期獲得總體最優(yōu)。滿意度函數(shù)的平衡尺度d的范圍為0～1，d=0說(shuō)明響應(yīng)值嚴(yán)重偏離目標(biāo)值，d=1說(shuō)明響應(yīng)值與目標(biāo)值接近。大腸桿菌的生長(zhǎng)量OD600和Nmnat的活力都屬于望大特性，其滿意度函數(shù)定義為[13]：

表2 采用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼

(公式2)

(公式3)

2 結(jié)果與分析

2.1 NMN轉(zhuǎn)移酶生物合成模式的研究

按照1.2.2描述的培養(yǎng)方法，將重組大腸桿菌接種到初始培養(yǎng)基中，每隔1 h測(cè)OD600和Nmnat的酶活力大小，對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)Nmnat的生物合成模式進(jìn)行研究，結(jié)果如圖1所示。

從圖中可以看出，1 h ～8 h是重組大腸桿菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，8 h后菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期。在加入誘導(dǎo)劑IPTG前，重組大腸桿菌產(chǎn)Nmnat較少，加入IPTG后，產(chǎn)酶量隨著菌體的生長(zhǎng)逐步提高；在菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期(8 h)后，酶活水平仍在上升，12 h時(shí)達(dá)到最大值，說(shuō)明大腸桿菌產(chǎn)Nmnat與菌體生長(zhǎng)存在部分耦合的關(guān)系，即Nmnat隨著菌體的生長(zhǎng)逐步合成，當(dāng)菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期后，仍繼續(xù)合成Nmnat。因此，在后續(xù)的優(yōu)化研究中，需要尋求菌體生長(zhǎng)和Nmnat的活力均衡以獲得總體最優(yōu)。

圖1 重組大腸桿菌的菌體量增長(zhǎng)與Nmnat酶活力間的關(guān)系

2.2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3，以Nmnat活力和菌體生長(zhǎng)量OD600為響應(yīng)值的方差和顯著性分析見(jiàn)表4和表5。一般P<0.05時(shí)，相應(yīng)因素為顯著影響因子[13]。根據(jù)表4可知，以Nmnat酶活為響應(yīng)值時(shí)，甘油和MgSO4為顯著影響因子，均為負(fù)效應(yīng)；同理，根據(jù)表5，以菌體生長(zhǎng)OD600為響應(yīng)值時(shí)，胰蛋白胨和MgSO4為顯著影響因子，其中胰蛋白胨為正效應(yīng)，MgSO4為負(fù)效應(yīng)。因此，在TB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，適當(dāng)減小甘油和MgSO4的濃度有益于重組Nmnat的表達(dá)，而適當(dāng)增加胰蛋白胨濃度，減小MgSO4濃度則有利于大腸桿菌的生長(zhǎng)，其它因素影響效果不顯著。因此，選擇胰蛋白胨、甘油和MgSO4作為后續(xù)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的顯著影響因素。

2.3 最陡爬坡法試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，通過(guò)增加胰蛋白胨、減小甘油和MgSO4濃度可提高產(chǎn)Nmnat能力和菌體的生長(zhǎng)量，其它因素則遵循正效應(yīng)取較高值，負(fù)效應(yīng)取較低值的原則進(jìn)行取值。結(jié)果如表6所示：利用4號(hào)培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)獲得的Nmnat比活和菌體生長(zhǎng)量OD600均最大。從4號(hào)開(kāi)始，Nmnat比活和OD600均降低，說(shuō)明培養(yǎng)基中適量的氮源，碳源和硫酸鹽有助于Nmnat的重組表達(dá)和菌體生長(zhǎng)，因此選用4號(hào)培養(yǎng)基為Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

表3 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 以Nmnat為響應(yīng)值的PB設(shè)計(jì)方差及顯著性分析

注：*表示差異顯著(P<0.05)

表5 以O(shè)D600為響應(yīng)值的PB設(shè)計(jì)方差及顯著性分析

表6 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4 Box-Behnken 試驗(yàn)結(jié)果方差分析及滿意度分析

Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析見(jiàn)表7，利用Design Expert 8.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和多元回歸擬合，建立以Nmnat活力、OD600和總體滿意度D為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程，并對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)(表8～10)。

總體滿意度函數(shù)：根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，取公式(2)中Y1,min=10.5,Y1,max=15.0；Y2,min=4.7,Y2,max=6.1

以Nmnat酶活為響應(yīng)值的滿意度函數(shù)為：

(公式4)

以O(shè)D600為響應(yīng)值的滿意度函數(shù)為：

(公式5)

D=d1(Y1)0.7×d2(Y2)0.3

(公式6)

表7 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4.1 以Nmnat酶活為響應(yīng)值的方差分析

Nmnat活力(Y1) 與胰蛋白胨(X2)、甘油(X3)和MgSO4(X5)的二次多項(xiàng)回歸方程如下所示：

Y1=35.104-4.496X2+ 0.394X3+15.593X5-0.043X2X3+0.455X2X5+1.893X3X5+ 0.202 X22-0.154 X32-52.615X52

表8方差分析顯示，該回歸模型顯著(P<0.05)，說(shuō)明酶活力與各個(gè)變量之間存在顯著的線性相關(guān)，失擬性在置信區(qū)間95%水平上不顯著(P=0.465>0.05)，即方程失擬度較小，可以利用模型預(yù)測(cè)響應(yīng)值Nmnat與變量之間的關(guān)系。其中，一次項(xiàng)X2、X3、X5都不顯著，說(shuō)明單一的各因素對(duì)NMN轉(zhuǎn)移酶比活沒(méi)有顯著影響；交叉項(xiàng)X2X3顯著，X2X5和X3X5不顯著，說(shuō)明X2(胰蛋白胨)和X3(甘油)對(duì)Nmnat比活有顯著交叉影響；二次項(xiàng)X22、X32顯著。

表8 以Nmnat酶活為響應(yīng)值的回歸方程方差分析及顯著性檢驗(yàn)

注：R2= 90.4%(調(diào)整R2= 70.76%)

2.4.2 以O(shè)D600為響應(yīng)值的方差分析

OD600(Y2)與胰蛋白胨(X2)、甘油(X3)和MgSO4(X5)的二次多項(xiàng)回歸方程如下所示：

表9方差分析顯示，該回歸模型極顯著(P=0.008<0.01)，說(shuō)明響應(yīng)值OD600與各個(gè)變量之間存在極顯著的線性關(guān)系；失擬性在置信區(qū)間95%水平上不顯著(P=0.962>0.05)，說(shuō)明方程在回歸模型的擬合度好，可以實(shí)際預(yù)測(cè)響應(yīng)值(OD600)與變量之間的關(guān)系。其中，一次項(xiàng)X3顯著(P<0.05)，說(shuō)明甘油濃度對(duì)OD600有顯著影響；交叉項(xiàng)X2X3顯著，X2X5和X3X5不顯著，說(shuō)明X2(胰蛋白胨)和X3(甘油)對(duì)OD600有顯著交叉影響；二次項(xiàng)X32顯著，X22和X52不顯著。

表9 以O(shè)D600為響應(yīng)值的回歸方程方差分析及顯著性檢驗(yàn)

R2=84.8%(調(diào)整R2=72.13%)

2.4.3 以總體滿意度D為響應(yīng)值的方差分析

以總體滿意度D為響應(yīng)值的方差分析如表10所示，該模型顯著(P<0.05)，說(shuō)明方程在響應(yīng)值與變量之間存在顯著的線性關(guān)系；失擬性在置信區(qū)間95%水平上不顯著(P=0.574 > 0.05)，即失擬度較小，實(shí)驗(yàn)誤差在可接受范圍之內(nèi)，說(shuō)明該模型可以用于預(yù)測(cè)總體滿意度與變量之間的情況。多響應(yīng)值轉(zhuǎn)化為單響應(yīng)值即總體滿意度D，利用響應(yīng)面法求解D，得到理論最大總體滿意度為1.028，此時(shí)對(duì)應(yīng)的理論最優(yōu)發(fā)酵條件為胰蛋白胨10.5 g/L，甘油3.49 mL/L，MgSO40.45 g/L，相應(yīng)的理論Nmnat酶活為15.48 U/mg，OD600為6.04。由表7可知，以Nmnat酶活最大響應(yīng)值14.84 U/mg所對(duì)應(yīng)的菌體生長(zhǎng)量OD600為5.62進(jìn)行滿意度計(jì)算，此時(shí)滿意度D1為1.026；而以菌體生長(zhǎng)量OD600最大響應(yīng)值6.02所對(duì)應(yīng)的Nmnat酶活為12.79 U/mg進(jìn)行滿意度計(jì)算，滿意度D2為0.729，均低于理論最大總體滿意度1.208。這說(shuō)明滿意度函數(shù)法能合理在多響應(yīng)值之間取得均衡，適用于多響應(yīng)值的優(yōu)化。

表10 以總體滿意度D為響應(yīng)值的回歸方程方差分析及顯著性檢驗(yàn)

2.5 最佳條件的驗(yàn)證試驗(yàn)

為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法和滿意度函數(shù)法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化發(fā)酵條件，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果測(cè)得Nmnat比活為(15.45±0.02) U/mg，OD600為6.01±0.03，與預(yù)測(cè)值基本一致，說(shuō)明通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)方法得到的最優(yōu)發(fā)酵條件是可靠的，具有一定參考價(jià)值。

3 結(jié)論

本研究利用數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，將響應(yīng)面與滿意度函數(shù)相結(jié)合，對(duì)重組大腸桿菌產(chǎn)Nmnat的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果如下：

(1)PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果顯示，在初始TB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，適當(dāng)增加胰蛋白胨濃度，減小MgSO4的濃度，對(duì)重組大腸桿菌產(chǎn)Nmnat以及菌體的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。

(2)通過(guò)滿意度函數(shù)法將多響應(yīng)值化問(wèn)題轉(zhuǎn)化為單響應(yīng)變量?jī)?yōu)化，獲得總體最優(yōu)，所得最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基為酵母粉30 g/L，胰蛋白胨10.5 g/L，甘油3.49 mL/L，MgSO40.45 g/L，K2HPO440.5 g/L，KH2PO46.0 g/L，NH4Cl 1.5 g/L，NaCl 0.6 g/L，接種量1.5%，誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間12 h。在該優(yōu)化條件下，菌體生長(zhǎng)量OD600為6.01，Nmnat酶活由8.85 U/mg提高到15.48 U/mg，提高幅度達(dá)74.92%。運(yùn)用響應(yīng)面與滿意度函數(shù)相結(jié)合的優(yōu)化方法顯著提高了該重組大腸桿菌的產(chǎn)酶水平，同時(shí)為多響應(yīng)值的發(fā)酵優(yōu)化提供了參考。

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Optimization of NMN adenylyltransferase production by recombinant Escherichia coli using response surface methodology coupled with desirability function

DUAN Lin-lin, LI Hong-mei, HE Hai

University of Shanghai for Science and Technology, School of Medical Instrument and Food Engineering,Yangpu 200093,Shanghai，China

The fermentation conditions of NMN adenylyltransferase production by recombinantEscherichiacoliwere optimized. Biomass yield (OD600) and NMN adenylyltransferase activity were selected as response value during fermentation condition optimization. Peptone, glycerin and MgSO4were screened to be the three key components using Plackett-Burman design method. Then, the mathematical model reflecting the three main factors and the production level of enzyme was established by using the Box-Behnken design method. Finally, a satisfactory degree function was defined and the satisfactory solution was obtained. The final optimal fermentation conditions were: yeast extract 30 g/L, peptone 10.5 g/L, glycerol 3.49 mL/L, MgSO40.45 g/L, K2HPO440.5 g/L, KH2PO46.0 g/L, NH4Cl 1.5 g/L, NaCl 0.6 g/L, inoculum size of 1.5% and induction time of 12 h. After the validated experiment under above conditions, enzyme production and biomass of recombinant strain were increased by 74.92% and 23.92%, respectively.

NMN adenylyltransferase; fermentation optimization; desirability function; response surface methodology

10.3969/j.issn.1001-6678.2016.06.008

段琳琳(1990～)，女，碩士研究生。研究方向：微生物資源利用。E-mail:duanlinlin0303@163.com。

*通信作者: 李紅梅，博士，碩士生導(dǎo)師。Tel：021-55271117，E-mail: sunnysand@126.com。