蝦脊蘭屬植物DNA條形碼的確立

任陽陽 張夢婷 張嘉麗,2 樊佳佳 張曉存 王 俊,2 劉 霞,2

(1 武漢理工大學化學化工與生命科學學院，武漢，430070； 2 中國中醫科學院中藥研究所，北京，100700)

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蝦脊蘭屬植物DNA條形碼的確立

任陽陽1張夢婷1張嘉麗1,2樊佳佳1張曉存1王 俊1,2劉 霞1,2

(1 武漢理工大學化學化工與生命科學學院，武漢，430070； 2 中國中醫科學院中藥研究所，北京，100700)

目的：結合ITS2、psbA-trnH和matk序列對蘭科蝦脊蘭屬植物進行物種區分鑒定研究，并確立能準確鑒別蝦脊蘭屬植物的序列或者序列組合。方法：采用試劑盒法對已收集的6種蝦脊蘭屬植物進行總DNA的提取，通過擴增及測序，運用codencodeV4.2軟件對所得序列進行拼接與剪切，使用MEGA5.0對ITS2、psbA-trnH和matk序列3種序列分別進行比對分析，計算種內及種間Kimura 2-parameter(K2P)遺傳距離，構建Neighbor-joining(NJ)系統聚類樹。結果：實驗共得到序列56條(包含GenBank序列17條)，ITS2序列和matK序列其種內最大遺傳距離小于種間最小遺傳距離，而該屬psbA-trnH序列種內遺傳距離范圍和種間遺傳距離范圍有重合。結論：ITS2序列和matK序列可以作為蝦脊蘭屬部分植物的鑒定序列，而psbA-trnH序列不能用于蝦脊蘭屬植物的鑒定。

DNA條形碼；ITS2；psbA-trnH；matK；蝦脊蘭屬

蝦脊蘭屬(CalantheR.Br.)為蘭科地生草本植物，據《中國植物志》中記載，蝦脊蘭屬植物全屬約150種，分布于亞洲熱帶和亞熱帶地區、新幾內亞島、澳大利亞、熱帶非洲以及中美洲等地。蝦脊蘭屬植物有“蘭中西施”的美稱，可見其具有極高的觀賞價值，而該屬植物不僅外表絢麗還頗有藥用價值，在民間多做藥用，據文獻記載，蝦脊蘭屬植物具有活血止痛、清熱解毒等功效[1]，據報道，蝦脊蘭的酶水解產物為tryptanthrin，indirudin和isatin，這些水解產物在原植物中也存在，它們均具有抗白血病的作用。從蝦脊蘭乙醇提取物中可提取到1個具有抗菌活性的二氫菲；同時，在蝦脊蘭屬植物中還發現吲哚苷以及具有生理活性的生物堿，這些生物堿的存在使蝦脊蘭在傳統中藥中有抗炎、抗菌、抗毒素等作用[2]。然而蝦脊蘭屬植物分類復雜，因為不同種類植物特征性狀不明顯，所以給蝦脊蘭屬植物的鑒定帶來很大的困難，且蘭科植物也是生物多樣性保護的旗艦類群之一，蝦脊蘭屬作為蘭科植物的一種，在中國物種紅色名錄第一卷將其全部物種列為珍惜瀕危物種[3]。因此，尋找一種快速有效鑒別蝦脊蘭屬植物的方法對于蝦脊蘭屬植物具有長遠意義。迄今為止，對于蝦脊蘭屬植物的鑒定研究較少，一般只有傳統的鑒別方法，而傳統的鑒別對于蝦脊蘭屬資源短缺現狀來說是非常不利的。DNA條形碼技術為直接利用DNA序列進行物種的鑒定,具有獨一無二的可重復性,為藥用植物鑒定帶來了新的機遇。

DNA條形碼是指生物體內能夠代表該物種的，標準的、有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA片段；DNA條形碼技術是2003年由加拿大動物學家Hebert首次提出，即利用基因組中一段公認的標準短序列鑒定物種的分子診斷新技術[4-6]。其在生物分類和鑒定方面發展迅速，它能夠不受本身性狀和外界因素影響，從基因水平上提供一種鑒別依據。該技術不需要形態分類基礎，具有操作簡單、重復性高、樣品用量少等特點，因此該技術在生物物種鑒定與分類、珍稀瀕危和貴重生物資源保護、海關貿易監控、生物多樣性保護和中藥鑒定等領域得到廣泛運用。尤其在中藥鑒定中，陳士林課題組通過大量樣本實驗研究提出ITS2+psbA-trnH為主體的植物類DNA條形碼鑒定體系[7-10]，該體系具有良好的準確性與穩定性，但對于少數中藥ITS2+psbA-trnH序列還不足以對其進行準確的鑒定，因此需要結合其他片段來進行鑒定。matK序列是編碼成熟酶K蛋白的基因，是國際生物條形碼聯盟(CBOL)推薦的植物DNA條形碼核心序列[11-13]。我們利用3種不同的引物ITS2、psbA-trnH、matK對6種蝦脊蘭屬的植物進行DNA提取、擴增、測序通過比較其種間和種內遺傳距離從而確立能鑒別蝦脊蘭屬植物的序列或者序列組合，為蝦脊蘭屬植物的鑒別提供準確可靠的生物學方法，保障其用藥安全，同時也為保護蝦脊蘭屬瀕危藥用植物資源提供了新的鑒定技術。

1 材料與方法

1.1 材料 6種蝦脊蘭屬植物：棒距蝦脊蘭(Calantheclavata)、腎唇蝦脊蘭(Calanthebrevicornu)、蝦脊蘭(Calanthediscolor)、劍葉蝦脊蘭(Calanthedavidii)、鉤距蝦脊蘭(Calanthegraciliflora)、三褶蝦脊蘭(Calanthetriplicata)分別來自利川、廣西、廣州等不同地區，共計25份樣品，材料信息詳表見表1。

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA的提取 將實驗樣品用75%乙醇擦拭表面后，稱量每個樣品約20 mg，加入鋼珠，研磨粉碎。用DNA提取研磨儀(Retsch MM400，Germany)研磨2 min后，利用植物DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.，China)提取總DNA。

1.2.2 PCR擴增及測序 PCR擴增引物見表2。matK分析序列全部從GenBank上下載，其詳細信息見表3。PCR反應體系為25，體系內包含2×Tag PCR Mix 12.5(Tiangen Biotech公司，China)，引物(2.5/L)各1.0(TaKa Ra Biotech公司，China)，模板DNA2，雙蒸水8.5。PCR擴增程序：95 ℃ 4 min，(94 ℃ 30 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s)循環35次，72 ℃延伸10 min。將擴增后的樣品使用ABI3730XL測序儀(Applied Biosystems Co，USA)進行雙向測序。

表1 樣品信息表

表2 PCR擴增引物

1.2.3 數據處理 應用CodonCode Aligner V4.2(CodonCode公司，USA)對測序峰圖進行校對拼接，除去載體及引物區獲得相應序列。利用MEGA5.0對所有序列進行分析對比，并基于K2P模型對蝦脊蘭屬植物進行種內和種間遺傳距離分析，用鄰接(NJ)法構建系統聚類樹。

2 結果與分析

2.1 蝦脊蘭屬植物不同序列種內變異分析

2.1.1 蝦脊蘭屬植物ITS2序列種內變異分析 棒距蝦脊蘭共6條序列，長度263 bp。鉤距蝦脊蘭共3條序列，長度為258 bp，無變異位點。劍葉蝦脊蘭共3條序列，長度265 bp，無變異位點。腎唇蝦脊蘭共6條序列，長度為258 bp，無變異位點。

表3 GenBank所下載序列

2.1.2 蝦脊蘭屬植物psbA-trnH序列種內變異分析

棒距蝦脊蘭、鉤距蝦脊蘭、劍葉蝦脊蘭、腎唇蝦脊蘭、三褶蝦脊蘭、蝦脊蘭psbA序列長度、種內變異位點數等信息見表5。棒距蝦脊蘭共5條序列，長度為746 bp，以LRGZ111-1為主導單倍型，在3位點存在A-C變異。鉤距蝦脊蘭共3條序列，長度為780 bp，以GZ032-1為主導單倍型序列，存在20個種內變異位點。劍葉蝦脊蘭共3條序列，長度為683 bp，以LC1025-1為主導單倍型序列，存在12個種內變異位點。腎唇蝦脊蘭共6條序列，長度為858 bp，以LC922-1為主導單倍型序列，存在58個種內變異位點。三褶蝦脊蘭共4條序列，長度為598 bp，以GX1005-1為主導單倍型序列，在596位存在A-C變異、597位存在C-T變異。蝦脊蘭有來自GenBank的3條序列(序列號見表3)，長度為757 bp，以KC704336為主導單倍型序列，存在33個種內變異位點。

2.1.3 蝦脊蘭屬植物matK序列種內變異分析 此處所用的matK序列全部從GenBank上下載得到(序列號見表3)，棒距蝦脊蘭共2條序列，長度為1 662 bp，以KF67379為主導單倍型，存在6個種內變異位點。鉤距蝦脊蘭共3條序列，長度為1 690 bp，以KF673800為主導單倍型序列，在481位點存在A-G變異。劍葉蝦脊蘭共3條序列，長度為1 692 bp，以KF673796為主導單倍型序列，存在8個種內變異位點。三褶蝦脊蘭共3條序列，長度為1 690 bp，以KF673822為主導單倍型序列，存在101個種內變異位點。蝦脊蘭共2條序列，長度為666 bp，無變異位點。

2.2 蝦脊蘭屬植物不同序列種間變異分析 棒距蝦脊蘭、鉤距蝦脊蘭、劍葉蝦脊蘭、腎唇蝦脊蘭、三褶蝦脊蘭、蝦脊蘭3種不同序列長度范圍、種間變異位點數等信息見表4。

表4 蝦脊蘭屬種間不同序列特征

2.3 蝦脊蘭屬植物不同序列種內、種間遺傳距離分析 基于K2P遺傳距離，對蝦脊蘭屬3條不同的DNA條形碼候選序列的種內變異和種間變異結果進行分析。見表5。蝦脊蘭屬ITS2序列種間變異(0.032～0.166)大于其種內遺傳距離(0)，但是鉤距蝦脊蘭和腎唇蝦脊蘭其種間遺傳距離過小，表示此2種植物利用ITS2序列不能分開，但是通過分析其matK種間距離結果發現通過matK序列是可以將其分開。蝦脊蘭屬matK序列種間變異(0.009～0.430)大于其種內遺傳距離(0～0.004)，但是蝦脊蘭和棒距蝦脊蘭以及蝦脊蘭和劍葉蝦脊蘭遺傳距離過小表示2種植物利用matK序列不能分開，但是通過分析其ITS2種間距離結果發現，通過ITS2序列是可以將其分開。因此，綜上所述，ITS2序列和matK序列可以作為鑒別蝦脊蘭屬植物分子鑒定的序列組合。蝦脊蘭屬psbA-trnH序列種間遺傳距離(0.002～0.148)和種內遺傳距離(0～0.055)有重疊區，所以psbA-trnH序列不適用于蝦脊蘭屬植物的鑒定。

表5 蝦脊蘭屬不同基因序列種內和種間K2P遺傳距離匯總

注：*：平均值

2.4 蝦脊蘭屬植物不同序列的NJ樹的建立

2.4.1 本研究基于ITS2序列構建蝦脊蘭屬各個種間的NJ樹(圖1)結果表明，除了鉤距蝦脊蘭和腎唇蝦脊蘭被分在一枝，其他各個種都能通過ITS2序列被很好的區分開來。

圖1 基于ITS2序列構建蝦脊蘭屬各個種間的NJ樹

注：Bootstrap1000次重復，支上數值僅顯示自展支持率≥50%。

圖2 基于matK序列構建蝦脊蘭屬各個種間的NJ樹

注：Bootstrap1000次重復，支上數值僅顯示自展支持率≥50%。

2.4.2本研究基于matK序列構建蝦脊蘭屬各個種間的NJ樹(圖2)結果表明除了鉤距蝦脊蘭和腎唇蝦脊蘭外其他物種都能通過matK序列被很好的區分開。但是在前面種間遺傳距離的分析中得知，鉤距蝦脊蘭和腎唇蝦脊蘭種間遺傳距離是大于其種內遺傳距離的，而在NJ樹上其卻合為一枝，但是腎唇蝦脊蘭的matK序列網上只有一條，所以在此并不具有說服力，綜上可以得出，將matK序列作為ITS2序列的互補序列用來鑒別蝦脊蘭屬植物，其鑒別效率具有很高參考價值。

2.4.3本研究基于psbA-trnH序列構建蝦脊蘭屬各個種間的NJ樹(圖3)結果表明，大多數蝦脊蘭屬植物的psbA-trnH NJ樹都匯到一起，其分離效率很差，所以psbA-trnH序列不適用于蝦脊蘭屬植物的鑒定。

圖3 基于psbA-trnH序列構建蝦脊蘭屬各個種間的NJ樹

注：Bootstrap1000次重復，支上數值僅顯示自展支持率≥50%。

3 結論

近年來，DNA條形碼技術在生物分類和鑒定方面發展迅速，它能夠不受本身性狀和外界因素影響，從基因水平上提供一種鑒別依據。我們在本文是通過對蝦脊蘭屬6個樣品3種不同DNA序列進行對比分析，從而確定能鑒定蝦脊蘭屬植物的序列或序列組合，為保證其用藥安全以及保護瀕危物種提供一種快速簡便的鑒定方法。

本研究收集了來自廣州、廣西、利川等地的6個蝦脊蘭屬樣品，選用ITS2序列、psbA-trnH序列和matK序列，對其變異位點進行分析，應用基于K2P計算的遺傳距離分別對3種序列的種內和種間距離進行比較分析結果表明，ITS2序列和matK序列其種內遺傳距離小于種間遺傳距離，可以將其作為基因組序列用于蝦脊蘭屬植物的鑒定，而psbA-trnH序列種內遺傳距離范圍和種間遺傳距離范圍有重合，所以psbA-trnH序列不能用作蝦脊蘭屬植物的鑒定。之后利用3種片段分別構建NJ樹可以看出，ITS2和matK序列除了鉤距蝦脊蘭和腎唇蝦脊蘭聚為一枝外，其他各個物種都能很明顯的區別開來，表現出很好的單系性，而腎唇蝦脊蘭的matK序列只有網上一條，在此并不能否定matK序列對蝦脊蘭屬植物的鑒定效率，所以利用ITS2+matK基因組序列能夠對蝦脊蘭屬植物進行快速鑒別。而psbA-trnH序列NJ樹的表明，蝦脊蘭屬大部分植物不能被區分，其鑒定準確率太低，不適于蝦脊蘭屬植物的鑒定。

[1]龍波,龍春林,李蘇梅.蘭科藥用植物[A].亞太地區民族植物學論壇,2006.

[2]蘇文君,龍波,劉飛虎.蝦脊蘭屬植物研究現狀[J].北方園藝,2012(16):190-193.

[3]黃衛昌,周翔宇,倪子軼,等.基于標本和分布信息評估中國蝦脊蘭屬植物的瀕危狀況[J].生物多樣性,2015,23(4):493-498.

[4]程新瑋,趙煥新,寧康,等.DNA條形碼技術在中藥質量評價中的研究進展[J].食品與藥品,2013,15(14):295-299.

[5]Coghlan M L,Haile J,Houston J,et al.Deep sequencing of plant and animal DNA contained within Traditional Chinese Medicines reveals legality issues and health safety concerns[J].PLoS Genet,2012,8(4):436-446.

[6]陳士林.中國藥典中藥材DNA條形碼標準序列[M].北京：科學技術出版社,2015.

[7]陳士林,姚輝,韓建萍,等.中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則[S].中國中藥雜志,2013,38(2)：141-147.

[8]Wong KL,But PP,Shaw PC.Evaluation of seven DNA barcodes for differentiating closely related medicinal Gentiana species and their adulterants[J].Chin Med,2013,8(1):16.

[9]胡偉毅,邵套喜.matK序列作為DNA條形碼在蒼耳屬中的應用[J].雜草科學,2013,31(4):13-16.

[10]姬生國,潘勝利,王峻,等.基于葉綠體matK基因序列探討10種石杉科石杉屬植物的系統關系及分子鑒定[J].中國中藥雜志,2007,32(19):1971-1974.

[11]滕艷芬,吳曉俊,徐紅,等.石斛及其常見混淆品的matK基因序列比較[J].中國藥科大學學報,2002，33(4):280-283.

[12]王果平,樊叢照,朱軍,等.基于形態特征和DNA條形碼技術的維吾爾藥材沙棗基原鑒定[J].中國中藥雜志,2014,39(12):2216-2221.

[13]余亞東,石林春,馬曉沖,等.白術與蒼術及其混偽品DNA條形碼鑒定研究[J].中國中藥雜志,2014,39(12):2194-2198.

[14]石林春,陳俊,向麗,等.基于ITS2條形碼的中藥材天南星及其混偽品DNA分子鑒定[J].中國中藥雜志,2014,39(12):2176-2179.

[15]吳勁松,張宇思,劉薇,等.白及屬藥用植物DNA條形碼的確立及其應用[J].藥學學報,2014,49(10):1466-1474.

[16]馬孝熙,任偉超,向麗,等.蒲黃、松花粉等花粉類藥材及其混偽品的DNA條形碼鑒定[J].中國中藥雜志,2014,39(12):2189-2193.

[17]于俊林,趙莎,任明波,等.基于ITS2條形碼鑒定柴胡與大葉柴胡[J].中國中藥雜志,2014,39(12):2160-2163.

[18]張雅琴,石鉞,宋明,等.蕨類藥材石韋及其混偽品的psbA-trnH序列鑒定[J].中國中藥雜志,2014,39(12):2222-2226.

[19]SUN ZY,GAO T,YAO H,et al.Identification of Lonicera japonica and its related species using the DNA barcoding method[J].Planta Med，2011，77:301-306.

[20]宋明,張雅琴,林韻涵,等.基于ITS2和psbA-trnH序列對細小種子類藥材車前子的鑒定比較[J].中國中藥雜志,2014,39(12):2227-2232.

(2016-03-31收稿 責任編輯：洪志強)

Establishment of DNA barcode for the calanthe

Ren Yangyang1,Zhang Mengting1,Zhang Jiali1,2,Fan Jiajia1,Zhang Xiaocun1,Wang Jun1,2,Liu Xia1,2

(1SchoolofChemistry,ChemicalEngineeringandLifeSciences,WuhanUniversityofTechnology,Wuhan430070,China; 2ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,InstituteofChineseMateriaMedica,Beijing100700,China)

Objective:Combined with the ITS2 and psbA-trnH and matK sequence to identify the medicinal plant-calanthe，and establish genus sequences which can accurately identify the calanthe.Methods:Extracting total DNA from 6 species of calanthe，which had been collected by the kit method，Then the sequences were amplified and sequenced，Using codencodeV4.2 software to of splic and shear the sequences，Comparing of all sequences of 6 species of the genus using MEGA5.0 software,The variable sites,the Kimura 2-Paramter(K2P)genetic distances and the Neighbor-joining(NJ)phylogenetic tree were computed by MEGA5.0.Results:56 sequences(including 17 GenBank sequences)were obtained f.By analysis，ITS2 sequence and matK sequence of the intraspecific genetic distance is less than the inter species genetic distance，the intraspecific genetic distance and inter species genetic distance of psbA-trnH sequence was coincident.Conclusion:ITS2 sequence and matK sequence can be used as the identification sequence of the partial plants of the calanthe,however psbA-trnH sequence could not be used for the identification of the calanthe.

DNA barcode; ITS2；psbA-trnH；matK；Calanthe

國家重大科技專項子課題“中藥新藥安全性檢測技術與標準研究”——中藥原料藥混偽品分子基因鑒定技術與標準(編號：2014ZX09304-307-001-020)

任陽陽(1992.09—)，女，碩士研究生，研究方向：中藥資源鑒定

劉霞(1973.02—)，女，博士，副教授，碩士生導師，主要研究方向：中藥資源與鑒定，E-mail:lrx1125@126.com

R282.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.11.058