醬香大曲產香酵母的分離及鑒定

羅小葉，邱樹毅，陸安謀，王曉丹，3*

1(貴州大學,貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽，550025) 2(貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽，550025) 3(貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽，550025) 4(貴州中心釀酒集團酒業有限責任公司，貴州 遵義，564500)

醬香大曲產香酵母的分離及鑒定

羅小葉1，2，邱樹毅1，2，陸安謀4，王曉丹1，2，3*

1(貴州大學,貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽，550025) 2(貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽，550025) 3(貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽，550025) 4(貴州中心釀酒集團酒業有限責任公司，貴州 遵義，564500)

采用可培養方法對醬香大曲酵母進行分離、鑒定，共篩選出12株酵母，用高粱培養基對酵母的產香功能進行初篩，通過感觀評定確定1株主要產果香味的酵母菌株，被篩選出的酵母經形態學觀察、生理生化實驗及26S rDNA 分子生物學分析鑒定，確定為扣囊復膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)。對產香酵母風味成分進行氣相色譜-質譜聯用儀(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)檢測分析。結果表明，醇類物質相對百分含量提高了51.87%，包括乙醇、異丁醇、異戊醇、苯乙醇等，這些醇類物質共同賦予發酵產物果香味；酯類物質相對百分含量提高了41.39%，包括乙酸乙酯、乙酸異戊酯呈現清靈果香，其他產物如丁酸乙酯、2-甲基丁基乙酸酯、丙酸正戊酯、辛酸乙酯、十六酸乙酯等也在不同程度上呈現出果香味；還檢測到少量的酚類、酮類、醛類、烷烴類以及少量未定成分的物質。對醬香大曲產香酵母分離篩選及功能特性進行研究，為深入研究醬香型白酒呈香機制提供基礎數據和理論依據，進一步挖掘酵母資源在白酒生產中的作用。

醬香大曲；酵母；氣相色譜-質譜聯用儀

酵母的種類及數量影響白酒的產量和質量[1]，同時代謝生成大量不同的風味物質，對醬香型白酒獨特風格的形成具有重要作用。高溫制曲是醬香型白酒生產的一大特色，大曲培養管理曲坯溫度變化分3個階段，首先低溫培菌期，品溫30～40 ℃，霉菌、細菌、酵母等大量繁殖；進入高溫轉化期，品溫50～65 ℃，讓已大量生成的菌代謝轉化成香味物質；最后進入后火排潮生香期，品溫不低于45 ℃，以后火促進曲心少量多余的水分揮發和香味物質的呈現[2]。酵母菌特殊的細胞結構特性能使其對高溫的承受能力有限，因而酵母主要在制曲過程的前期大量繁殖，一般占2%～5%，而在大曲后火排潮生香期很少或未檢測到酵母菌[3]。成品曲經入庫貯存期6個月，庫房四面通風保持冷涼干燥狀態，貯存期間處于休眠的酵母在適宜溫度、濕度條件下生長活躍起來，出庫時曲塊粉碎成曲粉與高粱混合進入釀造過程。本課題組利用純培養技術對多種醬香大曲生產用曲粉中酵母計數，表明曲粉中存在酵母，其數量約為103CFU/g[4]。盡管高溫制曲工藝降低了大曲中酵母的數量，但曲粉中仍然有一定數量的酵母，挖掘生產用曲粉酵母資源及探索其功能是有意義的。

茅臺酒廠技術中心在2001～2006年對茅臺酒制曲發酵過程中微生物的消長規律做了系統研究，共分離到了18種酵母，包括假絲酵母、絲孢酵母、漢遜酵母、異常漢遜酵母、畢赤酵母、紅酵母、擬內孢霉、白地霉等酵母[5]。此外，還從醬香大曲中分離到了卡斯特假絲酵母、費比恩畢赤酵母、拜耳結合酵母、Zygosaccharomycesbailii、Stephanoascusciferrii、Pichiameyerae、Cryptococcusneoformans等酵母[1，6]。引入現代分子生態技術來研究醬香大曲中的酵母，發現大曲中還存在Candidasilvae、熱帶假絲酵母[7]。

產香酵母是中國白酒中酯香的主要產生菌，能夠產生以酯香為主的多種香味，這些香味物質對賦予酒體濃郁的芳香及促進酒體完美和豐滿具有重要作用。茅臺酒廠技術中心分離到2株產香功能酵母能夠產生多種香味物質[8]。研究發現東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)能產生有機酸類和高級醇類香味物質[9]，卡斯特假絲酵母(Candidacasterllani)能產生乙酸乙酯、異丁醇等香味物質[10]。本課題組從醬香型白酒酒醅中分離出2株產乙酸乙酯、異戊醇、乙酸苯乙酯等香味物質較高的酵母[11-12]。

成品曲在出房后的貯存過程中，繼續網絡周圍環境中的酵母發酵生長。釀酒生產使用的是貯存6個月成品曲經過粉碎與高粱混合進行釀酒生產，因此在生產用的曲粉中有大量的酵母能夠被檢測到。酵母對大曲香味物質及前體形成具有重要作用，醬香白酒的生產每一次入窖都要進行撒曲，酵母能夠通過撒曲進入制酒過程進行發酵和產香。特此對醬香型白酒發酵生產使用的大曲曲粉中的酵母進行分離篩選，探索酵母的產香功能特性，為深入研究醬香型白酒呈香機制提供基礎數據和理論依據，對進一步挖掘酵母資源在白酒生產中的應用及開發我國酒曲中傳統微生物資源具有一定價值。

1 材料與方法

1.1 材料

醬香大曲：由貴州中心釀酒集團酒業有限公司提供，該集團坐落于貴州茅臺鎮，始建于1982年，與茅臺集團僅一河之隔，同享得天獨厚的水土、氣候等自然條件和空中微生物群資源。本研究所用醬香大曲是采用茅臺鎮傳統工藝制得，在白酒釀造車間取粉碎后待生產使用的曲粉，采用隨機取樣法在存放處的包裝袋中取20個樣品混勻，其品溫、水分、微生物區系等均比較穩定，能充分代表該醬香大曲中微生物組成特點，樣品4 ℃保存。

1.2 主要培養基

(1)孟加拉紅瓊脂培養基、麥芽汁瓊脂培養基、麥芽汁液體培養基、PDA瓊脂培養基、玉米粉瓊脂培養基、麥氏培養基(市售：上海博微生物科技有限公司)。

(2)生理生化培養基[13]。

(3)高粱小麥培養基：其中高粱與小麥質量比為1∶1，小麥全部粉碎，高粱整粒∶碎粒質量比為3∶1；加水量50%～60%，混勻后90 ℃熱水潤糧4 h；將培養基盛裝放入滅菌鍋內121 ℃滅菌蒸煮20 min；待培養基冷卻到60 ℃加入糖化酶(200 U/g)，調節培養基pH至4.0～4.5，在60 ℃水浴鍋糖化4 h；裝瓶，121 ℃滅菌20 min。其中選用本地高粱作為產香篩選培養基的主要原料，培養基的原料及培養基的制作流程與釀造生產醬香型白酒的相同，高粱的無機元素及維生素含量豐富，為微生物的生長與繁殖提供物質基礎，高粱中COA 對產己酸有利，且對酯化亦有促進作用。高粱所含單寧，味苦澀、性收斂，對酶有鈍化作用，降低發酵力，酒醅中適當的單寧含量可使酒醅發酵率高，單寧經蒸煮發酵，可轉變成芳香物質，賦予白酒特殊的香氣，并有抑制雜菌的作用[14-15]，因此更能模擬和體現酵母在釀造過程的代謝情況。

1.3 主要試驗試劑與儀器

糖化酶(市售)，山東隆大生物工程有限公司；酵母DNA提取試劑盒，美國BIOMIGA公司；其他試劑均為分析純(市售),上海博微生物科技有限公司)。

離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司；Flex cycler多功能PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀，德國耶拿分析儀器股份公司；HP6890/5975C GC-MS聯用儀，美國安捷倫公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS，Stableflex(2cm)萃取頭，SUPELCO。

1.4 試驗方法

1.4.1 酵母分離純化

稱取樣品10 g至裝有滅菌玻璃珠的90 mL 無菌生理鹽水(9 g/L)的三角瓶中，混勻，30 ℃、160 r/min振蕩培養30 min備用。取上清液1 mL進行梯度稀釋，取10-2，10-3，10-4，10-5濃度梯度稀釋液200 μL于孟加拉紅培養基上，用涂布棒涂布均勻，30 ℃倒置培養2 d，挑選具有典型酵母菌落形態特征的菌株在平板上劃線純化，再挑取單菌落進行斜面保存并編號，重復實驗3次[16]。

1.4.2 產香酵母的篩選

將上述純化篩選出的酵母菌株接入20 mL麥芽汁液體培養基，30 ℃、160 r/min擴培48 h，使得酵母菌達到108數量級，按4%接種量接入高粱小麥培養基，以不接種酵母菌株擴培液的高粱小麥培養基為空白對照，30 ℃發酵25 d，每24 h扣瓶1次，發酵結束進行感官評定[2]，邀請10位專業品評人員在本課題組白酒專業品評室對發酵產物的酯、酸、酒味進行感官評定，各指標按照1～10數字評分，數值越大代表氣味越強，最后取10組數據的平均值作為各菌株各指標的最終得分，篩選總體得分最高的菌株。

1.4.3 產香酵母鑒定

1.4.3.1 形態特征觀察鑒定

將產香菌株分別接種于PDA瓊脂培養基和孟加拉紅瓊脂培養基上，30 ℃倒置培養2 d，觀察并記錄菌落形狀、顏色、透明度、邊緣、質地情況等菌落特征。

1.4.3.2 鏡檢特征觀察

在潔凈載玻片上滴加1滴美藍染液，用接種環涂布少許菌體涂均勻并蓋上蓋玻片，100倍油鏡下觀察細胞形態特征[16]；同時將酵母接種于玉米粉瓊脂培養基和麥氏培養基上，30 ℃倒置培養3 d，觀察所篩選酵母菌假菌絲情況[17]，30 ℃倒置培養7 d觀察子囊孢子情況并分別記錄酵母各項特征[18]。

1.4.3.3 生理生化特征鑒定

對產香酵母進行碳源同化實驗、氮源同化實驗、糖發酵實驗、缺維生素實驗、產類淀粉實驗、脲酶實驗，并參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》加以對比鑒定[13，19]。

1.4.3.4 分子鑒定

(1)酵母DNA提取：參照酵母DNA提取試劑盒(美國BIOMIGA公司)說明書進行DNA提取；

(2)26S rDNA D1/D2區域的PCR擴增[20]：PCR反應體系：Mix 12.5 μL，NL1 1 μL，NL4 1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。引物對合成由上海立菲生物技術有限公司完成(引物序列：NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAA AG-3′)/NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)。

(3)PCR擴增程序：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共35個循環，72 ℃ 10 min，1%瓊脂糖電泳后在凝膠成像儀上確認目標產物有無及DNA提取效果，所得 PCR 產物經純化送交上海立菲生物工程技術服務有限公司測序。

(4)將測序數據在GenBank數據庫中進行同源序列搜索，選取同源性較高的相關菌株的26S rDNA D1/D2 區域序列作為參比對象[21]；用MEGA5.05軟件進行多序列比對，并用鄰接法(Neighbor-Joining)構建系統發育樹[22]。

1.4.4 產香酵母香味物質GC-MS分析[12]

將1.4.2篩出的產香酵母的香味物質及空白對照進行GC-MS分析，其中色譜柱為ZB-5MSI 5% Phenyl-95% Di Methylpolysiloxane (30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細管柱；升溫程序：柱溫35 ℃(保留1 min)，以4 ℃/min升溫至135 ℃，保持2 min，再以8 ℃/min升溫至180 ℃，保持5 min；載氣流量0.8 mL/min；分流比10∶1。樣品預處理：取高粱小麥發酵樣品20 g，置于固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有2cm-50/30μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纖維頭的手動進樣器，在80 ℃頂空萃取40 min；進樣：快速移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進樣口(溫度250 ℃)中，熱解析2 min，溶劑延遲時間2 min，掃描方式為全掃描。對總離子流圖中的各峰經質譜計算機數據系統檢索及核對Nist2005和Wiley275標準質譜圖，確定揮發性化學成分，用峰面積歸一化法測定各化學成分的相對質量分數。

2 結果與分析

2.1 酵母分離純化

采用可培養方法，從該曲粉樣品中共分離出12株菌，根據菌落形態的差別共歸為5類，其菌落形態描述見表1。

表1 醬香型大曲中酵母菌落形態描述

2.2 產香酵母的篩選

將分離純化的12株菌進行高粱小麥發酵，其感官評定結果如表2所示。結果表明，FBKL2.0094菌株總評分最高為18分，其中酯味的感官評分最高為9分，酸味6分，酒味3分，這與該發酵產物所呈現的濃郁果香味相吻合；FBKL2.0084、FBKL2.0085、FBKL2.0087、FBKL2.0089、FBKL2.0090、FBKL2.0093、FBKL2.0095 7株菌總評分均為16分，該7株菌的香味評定低于FBKL2.0094；FBKL2.0088和FBKL2.0092 2株菌的發酵產香最弱。FBKL2.0094菌株香味物質香味最濃，且以果香味為主，最終確定FBKL2.0094菌株為產香功能菌。

表2 酵母發酵產香感官評價

2.3 產香菌株FBKL2.0094的鑒定

篩選得到產香菌株實驗室保藏編號為FBKL2.0094，在中國典型培養物保藏中心的保藏編號為CCTCCM2015382。

2.3.1 FBKL2.0094酵母菌落形態描述

表3 FBKL2.0094酵母菌落形態描述

PDA培養基 孟加拉紅培養基圖1 FBKL2.0094酵母菌在兩種培養基上菌落形態Fig.1 Morphology of yeasts colonies of FBKL2.0094 on two kinds of medium

2.3.2 鏡檢特征

對FBKL2.0094酵母菌進行顯微鏡鏡檢，其結果特征如下表4及圖2所示。

表4 FBKL2.0094酵母顯微形態

圖2 FBKL2.0094酵母顯微形態Fig.2 The microscopic morphological description of FBKL2.0094 yeast

2.3.3 生理生化實驗

生理生化實驗結果表明，FBKL2.0094酵母能夠發酵葡萄糖、麥芽糖及蔗糖，不能發酵乳糖，不能利用棉子糖，但能利用木糖，不能利用硝酸鉀，在缺維生素的培養基上不能生長，不能產生類淀粉，不能分解尿素。結合《酵母菌的特征與鑒定手冊》及該菌的顯微形態，該菌能產生子囊孢子和假菌絲，生殖方式為芽殖，可推測該菌與扣囊復膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)相似度較高。

2.3.4 分子鑒定

將FBKL2.0094酵母測序數據在GenBank數據庫中進行同源序列搜索(BLAST search)，系統發育樹如圖3。FBKL2.0094與扣囊復膜酵母(SaccharomycopsisfibuligeraJX645719)具有較高的同源性，相似度為100%。

圖3 FBKL2.0094酵母系統發育樹Fig.3 The phylogenetic tree of FBXL2.0094 yeast

結合以上試驗，將該酵母鑒定為扣囊復膜酵母(Sacchaomycopsisfibuligera)，該菌與扣囊擬內孢霉(Endomycopsisfibuligera)同物異名[23]。對醬香大曲中的酵母研究發現扣囊復膜酵母是醬香大曲中的優勢酵母[7]，茅臺技術中心在茅臺酒制曲發酵過程中微生物進行分離時分離到擬內孢霉[1，6]。從燒酒曲、清香型小曲酒醅中曾分離鑒定出[24-25]。利用高通量測序法對清香大曲酵母群落結構分析及利用DGGE技術對甜酒曲中酵母多樣性進行分析結果皆表明扣囊復膜酵母是酒曲中的主要酵母類型[26-28]。

2.4 FBKL2.0094揮發性成分分析

FBKL2.0094進行高粱小麥發酵產香，結果表明該酵母香味物質呈現濃郁的果香味，香味濃郁且柔和，將該菌株發酵產物及對照經固相微萃取后進行GC-MS分析檢測，得到各揮發性組分名稱及相對百分含量，如圖4所示。

注：對照為未接種酵母菌株的高粱小麥培養基的揮發性成分。圖4 FBKL2.0094香味物質揮發性成分分析Fig.4 The volatile components analysis of FBKL2.0094 in solid-state fermentation

與對照相比，可看出FBKL2.0094揮發性香味成分中，醇類物質相對百分含量最高為53.42%，而對照中醇類物質相對百分含量僅為1.55%，這些醇類物質包括乙醇、丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇、苯乙醇等共同賦予發酵產物酒香味和果香味。酯類物質的相對百分含量為41.50%，而對照中酯類物質相對百分含量僅為0.11%，其中檢測到的酯類物質包括乙酸乙酯含量3.89%，表現出清靈、微帶果香的酒香，乙酸異戊酯含量占到1.85%，表現出較強的新鮮果香，其它產物如丁酸乙酯、2-甲基丁基乙酸酯、丙酸正戊酯、辛酸乙酯、十六酸乙酯等也在不同程度上呈現出果香味。在對照中酮類、醛類、呋喃類及烷烴類物質相對百分含量略高于產香菌株，表明部分醛酮類物質反應生成醇類物質，呋喃類化合物感官特征主要伴有焦糖和水果氣味，在發酵過程中，部分呋喃類化合物發生氧化、還原反應[2]。在對照中檢測到烯類和酸類物質在產香菌株中未檢測到，其中烯類物質經化學反應生成醇類物質，而酸類化合物在酒中既是重要呈味物質又是酯類化合物的前提物質[2]，酸類物質和醇類物質經酯化反應生成大量酯類物質。扣囊復膜酵母能改善液態法釀造糯米酒口感淡寡的缺點，以增加酒體芳香類物質種類及含量[29]。在醬香大曲中分離到的扣囊復膜酵母具有產果香功能為醬香型白酒的風味有貢獻作用。

3 結論

通過對醬香大曲產香酵母分離篩選及功能特性進行研究，采用可培養方法對醬香大曲酵母進行分離、鑒定，共篩選出12株酵母，用發酵高粱小麥培養基對酵母的產香功能進行初篩，通過感觀評定確定1株主要產果香味的酵母菌株，鑒定為扣囊復膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)。對產香酵母發酵高粱小麥后揮發性成分進行GC-MS分析，該菌在高粱小麥上代謝產生大量醇類和酯類物質使醇類物質相對百分含量提高了51.87%；使酯類物質的相株對百分含量提高了41.39%，從而賦予發酵產物濃郁的果香味，最終得到1株具有產果香功能的酵母菌株。

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Isolation and identification of aroma-producing yeast in Moutai-flavorDaqu

LUO Xiao-ye1，2, QIU Shu-yi1，2, CHEN Mei-zhu1,3, LU An-mou4, WANG Xiao-dan1，2，3*

1(Guizhou Provincial Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy,Guizhou University, Guiyang 550025,China) 2(School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China) 3(College of Life Sciences,Guizhou University,Guiyang 550025,China) 4(Zhong Xin Brewery Group Co. Ltd, Zunyi 564500,China)

Cultivable methods were used to isolate and identify the yeast from Moutai-flavorDaquand 12 yeast strains were selected. Sorghum medium was used to screen these yeast strains with aroma-producing ability and one strain producing strongest fruit flavor were screened out through sensory evaluation. By morphological observation, physiological and biochemical experiments and molecular biological analysis of 26S rDNA, this yeast strain was identified asSaccharomycopsisfibuligera. The flavor components of this aroma-producing yeast strain were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The results showed the relative content of alcohols including ethanol, isobutanol, isoamyl alcohol, phenethyl alcohol etc increased by 51.87%, which gave rise to fruit flavor of fermented products. The relative percentage of esters including ethyl acetate and iso-amyl acetate increased by 41.39%, andresulted in Qing-Ling fruit flavor. Other products such as ethyl butyrate, 2-methylbutyl acetate, N-amyl propionate, ethyl caprylate and ethyl palmitate etc also showed fruit flavor at varying degrees.Minor amounts of phenols, ketones, aldehydes, alkanes and little undetermined constituents were also detected. Research on functional properties of the isolated yeast strains from Moutai-flavorDaqucould not only provide basic data and theoretical basis for further study on aroma mechanism, but also could further explore the role of yeast resources in Moutai-flavor liquor production.

Moutai-flavorDaqu;yeast;gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201612005

碩士研究生(王曉丹工程師為通訊作者，E-mail：wangxiaodan0516@126.com)。

貴州省重大專項項目(黔科合重大專項字[2013]6009號)；貴州省省校合作計劃項目黔科合LH字[2014]7672

2016-06-16，改回日期：2016-07-23