不同容器發酵水豆豉對便秘的防治效果及機制

馮霞，趙欣

(1.重慶第二師范學院 重慶市功能性食品協同創新中心，重慶 400067；2.重慶第二師范學院 重慶市功能性食品工程技術研究中心，重慶 400067；3.重慶第二師范學院 功能性食品研發重慶市工程實驗室，重慶 400067；4.重慶第二師范學院 生物與化學工程系，重慶 400067)

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不同容器發酵水豆豉對便秘的防治效果及機制

馮霞1,2,3,4，趙欣1,2,3,4

(1.重慶第二師范學院 重慶市功能性食品協同創新中心，重慶 400067；2.重慶第二師范學院 重慶市功能性食品工程技術研究中心，重慶 400067；3.重慶第二師范學院 功能性食品研發重慶市工程實驗室，重慶 400067；4.重慶第二師范學院 生物與化學工程系，重慶 400067)

對不同容器發酵水豆豉乙醇提取物的便秘預防效果及作用機制進行了研究.對活性炭誘導便秘的小鼠灌胃不同容器發酵水豆豉提取物后發現對照組(活性炭誘導便秘)小鼠的體重下降最多，活性炭在小腸中的推進率最低，排出首粒黑便的時間也最長；相比于對照組玻璃容器發酵水豆豉(GVFS)提取物可以緩解便秘小鼠的體重下降，提高活性炭的推進率和減少排出首粒黑便時間.同時相對于對照組，GVFS可以提高小鼠血清MTL、Gas、ET、AchE、SP、VIP的水平和降低SS水平，且對這些血清水平的影響顯著強于陶瓷容器發酵水豆豉(CVFS)提取物和塑料容器發酵水豆豉(PVFS)提取物.RT-PCR實驗結果顯示GVFS組小鼠的c-Kit、SCF、GDNF mRNA表達高于PVFS、CVFS組和對照組，而TRPV1、NOS表達僅高于正常組.由此可見，水豆豉具有良好的便秘預防效果，且玻璃容器發酵提取物能夠使水豆豉具有更好的效果，主要原因可能是由于GVFS含有較高含量的大豆異黃酮.

水豆豉；容器；便秘；活性炭；小鼠

水豆豉是一種傳統大豆發酵食品,在中國四川地區被當作調味料和菜品使用已經有上千年的歷史，作為保健食品和中藥也被長期使用，具有開胃、清熱和解毒等效果；通過現代科研手段也進一步發現水豆豉含有多種功能性成分，使其具有抗氧化、抗突變和抗癌效果[1].食品發酵過程中受到多種因素的影響，包括發酵時間、發酵溫度、菌種條件和水分含量等因素，由于水豆豉是自然發酵的食品，外界條件的變化對其品質都有直接的影響[2]；同時，人為的條件也可能對水豆豉的發酵產生影響，發酵過程的容器就是一種能對大豆發酵制品產生影響的人為給予條件[3].韓國有研究證明不同發酵容器發酵的大醬(大豆發酵制品)的品質之間有顯著差異[4]，進一步說明了容器有可能對大豆發酵制品的品質產生影響.

便秘不是一種疾病，但卻是一種腸胃功能異常的表現，這種機體的異常狀態如果長期持續會進一步引發許多慢性病，甚至可能導致心肌梗死、腦出血和結腸癌等嚴重的威脅生命的疾病[5].本研究團隊的研究證實水豆豉具有較好的腸胃保護作用，能通過調節機體的保護因子，起到預防胃損傷等作用[6].另外通過體外實驗也證明水豆豉具有體外抑制結腸癌細胞的效果，說明其對腸道也可能存在一定的保護作用[7].通過工業生產和家庭自制水豆豉的食用可能對腸道有保健功效，因此通過改進工藝提高水豆豉的保健功效一直是研究的重點.本研究通過比較塑料、陶瓷、玻璃這3種容器對水豆豉在便秘中的預防效果，找出能產生最好抑制便秘作用的水豆豉及其發酵容器，研究結果對進一步改良水豆豉生產工藝，保護水豆豉的生產和應用提供依據.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆：2014年秋季黑龍江省嫩江縣黑龍江農墾總局大西江農場出產.

胃動素(MTL)、胃泌素(Gas)、內皮素(ET)、生長抑素(SS)、血清乙酰膽堿酯酶(AchE)、P物質(SP)、血管活性腸肽(VIP)血清因子試劑盒，北京普爾偉業生物科技有限公司；CycleTESTTM PLUS DNA染色試劑盒，德國Becton Dickinson公司；Trizol試劑、oligodT18、RNase、dNTP 和MLV，美國Invitrogen公司；RT-PCR引物c-Kit、SCF、TRPV1、GDNF、NOS和GAPDH，天根生化科技有限公司；其余試劑均為國產分析純.

雌性6周齡SPF級KM(昆明)小鼠100只(體重20～25 g)購于重慶醫科大學動物實驗中心，動物許可證號：SCXK(渝)2012-0001.

LD2X-50FB立式壓力蒸汽滅菌鍋,江西華科精密儀器有限公司；PYX-DHS-50X65BS隔水式電熱恒溫培養箱，上海百典儀器設備有限公司；UV9600紫外分光光度計，北京北分瑞利分析儀器(集團)公司；Bio-Rad小型水平電泳槽，美國Bio-Rad公司；ABI 2720 PCR儀，美國Applied Biosystems公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 不同容器發酵水豆豉及提取

加入大豆量2倍的蒸餾水進行浸泡(12 h)，去除浸泡水后將大豆進行蒸煮(105 ℃，60 min)，然后將大豆冷卻至36 ℃后置于容器(陶瓷、塑料和玻璃容器)中進行保溫發酵(36 ℃，72 h).發酵完成后將水豆豉進行冷凍干燥，粉碎后的水豆豉中加入20倍量的體積分數80%的乙醇提取12 h，提取3次后合并提取液，減壓蒸干溶劑得到水豆豉提取物用以動物實驗.

1.2.2 不同容器發酵水豆豉中大豆異黃酮含量的檢測

以染料木素計測定水豆豉中大豆異黃酮含量，將染料木素標準品用體積分數80%的乙醇配制成質量濃度為0.002～0.020 g/L的標準溶液.使用Kromasil C18色譜柱(4.6 mm×25 mm，5 μm)；流動相為體積分數40%的甲醇；流速為1.0 mL/min；檢測波長為260 nm；柱溫為50 ℃；取染料木素標準品溶液20 μL注入六通閥中，測定樣品峰面積.求得回歸方程為Y=-316 706+4.20×108X(r2=0.995)，由此計算出標準曲線.再取0.2 g水豆豉提取物用無水乙醇定容至10 mL作為待測液，將待測液測定后對照染料木素標準曲線得到水豆豉中異黃酮含量值[8].

1.2.3 動物便秘實驗

通過1周適應環境喂養后將KM小鼠按體重(25.5 g左右)隨機平均分為5組，分別是正常組、對照組、CVFS(ceramic vessel fermented Shuidouchi，陶瓷容器發酵水豆豉)組、PVFS(plastic vessel fermented Shuidouchi，塑料容器發酵水豆豉)組和GVFS(glass vessel fermented Shuidouchi，玻璃容器發酵水豆豉)組，每組20只.實驗周期為9 d，正常對照組和對照組小鼠每天灌胃0.2 mL蒸餾水，CVFS、PVFS和GVFS組小鼠每天按4 g/kg(小鼠體重)分別灌胃水豆豉組提取物.從第5天開始除正常對照組外其他組小鼠每天灌胃0.2 mL活性炭水(質量濃度為100 g/L，2 ℃)，第8天灌胃活性炭水后各組小鼠均絕食24 h，第9天包括正常組在內所有小鼠灌胃0.2 mL活性炭水.每組20只小鼠再平均分為2組，一組30 min后斷頸處死小鼠，然后解剖取小鼠小腸觀察活性炭在小腸中的推進率，按推進率(%)=(活性炭在小腸中推進距離/小腸總長度)×100計算；另一組10只小鼠觀察其排出首粒黑便的時間[6].實驗過程中每天測定并記錄各組實驗動物的體重.

1.2.4 小鼠血清指標檢測

小鼠處死后心臟取血，然后將小鼠血漿在5 000 r/min下離心分離5 min，然后取上層血清，按試劑盒說明書測定小鼠血清中MTL(胃動素，motilin)、Gas(胃泌素，gastrin)、ET(內皮素，endothelin)、SS(生長抑制素，somatostatin)、AchE(乙酰膽堿酯酶，acetylcholinesterase)、SP(P物質，substance P)、VIP(血管活性腸肽，vasoactive intestinal peptide)的水平.

1.2.5 RT-PCR 實驗

用RNAzol 試劑提取小鼠小腸組織中的總RNA，在37 ℃下使用RNase-free DNase對提取到的總RNA進行消化15 min，然后使用RNeasy試劑盒純化RNA后將RNA濃度調整到1 μg/μL.在條件37 ℃ 120 min，99 ℃ 4 min，4 ℃ 3 min下，以RNA (2 μg)為模版，在逆轉錄酶的作用下合成cDNA.接著以反轉錄-聚合酶鏈反應法擴增c-Kit、SCF、TRPV1、GDNF、NOS和GAPDH(表1)的DNA表達，測量mRNA基因的轉錄水平，其中GAPDH是作為內參照的持家基因.最后以含10 g/L溴化乙錠瓊脂的電泳檢查各PCR擴增產物，并使用Image1.44軟件定量分析表達強度，計算水豆豉灌胃各組小鼠的相關基因與對照組小鼠的比值[9].

1.3 數據統計

實驗進行3 次平行測定，然后取3次實驗的平均結果標記為(平均±SD(標準偏差))，然后采用單因素方差分析(One Way ANOVA)，使用統計學軟件(SAS9.1)對各組數據之間的顯著差異性進行計算(P<0.05)[9]，然后用小寫字母進行標識，不同字母表示存在顯著差異性.

表1 RT-PCR引物

2 結果與分析

2.1 實驗過程中小鼠體重的變化

由圖1可知，在前5天各組小鼠的體重呈正常增長狀態，各組小鼠之間體重差別不大，無顯著差異(P>0.05).第5天開始由于使用活性炭誘導便秘，除正常組小鼠體重持續增長外，其他各組小鼠出現體重增長被抑制的情況，到第9天對照組小鼠的體重已經呈現大幅度的下降，CVFS、PVFS和GVFS組小鼠的體重也出現一定程度的下降，GVFS組小鼠體重顯著高于CVFS和PVFS組小鼠(P<0.05).便秘后會出現食欲不振的情況，影響正常的攝食，從而造成體重的下降，因此體重的異常下降是便秘的一個表現[10].水豆豉可以緩解活性炭誘導便秘造成的體重下降，且GVFS抑制體重下降的能力優于CVFS和PVFS，可見GVFS對便秘的抑制作用好于CVFS和PVFS.

不同字母表示對應組數據平均值存在顯著性差異(P<0.05)；相同字母表示對應組數據平均值不存在顯著性差異(P>0.05).圖1 實驗過程中小鼠的體重Fig.1 Body weight of mice during the experiment mice

2.2 不同容器發酵的水豆豉提取物對便秘小鼠排出首粒黑便時間的影響

由圖2可知，第9天灌胃活性炭水后各組小鼠排出首粒黑便的時間存在顯著差異(P<0.05).正常組排出首粒黑便的時間最短，僅為(61±6) min，對照組時間最長(183±11) min，水豆豉喂養各組排出首粒黑便的時間較對照組大幅度下降，CVFS組為(122±8) min，PVFS組為(110±9) min，GVFS組為(92±7) min.便秘會造成排便困難，使排便間隔時間大大高于正常狀態.通過動物實驗模擬便秘排便狀態，觀察活性炭水產生黑便的排出時間可以作為判斷便秘程度的一個指標[10].由此可以看出GVFS在3種不同容器發酵水豆豉中可以最大程度地緩解便秘.

圖2 不同容器發酵的水豆豉提取物對便秘小鼠排出首粒黑便時間的影響Fig.2 Influence on time of first black stool discharging in different vessels fermented Shuidouchi extracts treated constipation mice

2.3 不同容器發酵水豆豉提取物對活性炭在便秘小鼠小腸中推進率的影響

通過解剖小鼠，觀察小鼠小腸情況，可以看出誘導便秘使對照組小鼠的小腸總長度較其他各組略微縮短(表2)，活性炭水在正常組、GVFS組、PVFS組、CVFS組和對照組小腸中的推進距離依次下降.計算后可知，活性炭在正常組小鼠小腸中的推進率最高，在對照組中最低，在CVFS組中的推進率顯著高于其他2種水豆豉(P<0.05).活性炭在小腸中的推進率也是檢驗便秘狀態和小腸功能的重要指標，推進率高證明腸道功能正常，過低意味著便秘狀態造成的小腸功能失調，通過提高推進率可以起到恢復便秘狀態小腸功能的效果[11].實驗結果顯示GVFS可以有效地緩解便秘對小腸功能造成的影響，且效果優于CVFS和PVFS.

表2 不同容器發酵的水豆豉提取物對便秘小鼠小腸長度、活性炭推進距離和活性炭推進率的影響(每組小鼠數n=10)

不同字母表示對應組數據平均值存在顯著性差異(P<0.05)，相同字母表示對應組數據平均值不存在顯著性差異(P>0.05).

2.4 不同容器發酵水豆豉對小鼠血清MTL、Gas、ET、SS、AchE、SP和VIP水平的影響

由表3可知，正常組小鼠血清中的MTL、Gas、ET、AchE、SP、VIP含量比其他各組小鼠的含量更高，SS含量低于其他各組.但是對照組小鼠血清中的MTL、Gas、ET、AchE、SP、VIP含量顯著(P<0.05)低于其他各組，SS含量則顯著(P<0.05)高于其他各組.相比對照組小鼠，水豆豉可以提高血清MTL、MTL、Gas、ET、AchE、SP、VIP水平和降低SS水平，且GVFS使MTL、MTL、Gas、ET、AchE、SP、VIP增加和使SS降低的能力強于CVFS和PVFS，能使這些指標最接近于正常狀態.血清中的MTL、Gas、ET、SS、AchE、SP和VIP水平都與便秘有直接聯系，提升MTL、MTL、Gas、ET、AchE、SP、VIP和降低的SS可以有效地緩解便秘[6].MTL和Gas是影響腸道的胃腸激素，可調節小腸的運動，可以加強腸胃蠕動[12].ET能穩定血管張力，便秘會影響ET在腸道中的含量，使腸道的張力出現異常[13].AchE對腸道有調節運動的作用，可以促進胃腸蠕動，減輕便秘[14].SP是重要的胃腸激素，能夠直接加快結腸的收縮運動和刺激消化道平滑肌的收縮[15].VIP是一種能夠松弛腸道，促進腸道蠕動的神經傳遞物質，與便秘也有直接關聯[5].SS能夠抑制胃腸激素的釋放，降低平滑肌的收縮，減少胃排空率，這些都可能導致便秘.GVFS對這些血清中的便秘相關因子的正面作用可以有效地緩解便秘.

表3 實驗小鼠血清的MTL、Gas、ET、SS、AchE、SP和VIP水平(每組小鼠數n=10)

不同字母表示對應組數據平均值存在顯著性差異(P<0.05)，相同字母表示對應組數據平均值不存在顯著性差異(P>0.05).

2.5 不同容器發酵水豆豉對小鼠小腸中c-Kit和SCF的mRNA表達的影響

由圖3可知，相對于對照組小鼠的小腸組織，GVFS、PVFS和CVFS可以顯著上調便秘小鼠小腸中的c-Kit和SCF mRNA的表達(P<0.05)，且GVFS上調的幅度最大，可使上調后的c-Kit和SCF表達分別達到對照組小鼠的1.88和7.01倍.Cajal間質細胞(ICC)是一種在腸神經系統和平滑肌之間起重要作用的細胞，ICC可以調節平滑肌細胞中的腸神經信號，臨床研究顯示便秘狀態下肌體中的ICC水平下降，而c-Kit是ICC的特異性標志物，可以作為觀察ICC水平的重要標準[16].ICC只有在一定濃度的SCF下才能存活，阻斷c-Kit與SCF結合可導致ICC數目減少，SCF濃度降低會導致c-Kit的濃度下降，所以高水平的SCF表達對ICC的存活具有關鍵作用[17].GVFS可以有效地上調c-Kit和SCF表達，從而可能通過提高體內ICC的水平以達到緩解便秘的作用.

圖3 不同容器發酵水豆豉灌胃小鼠小腸中c-Kit和SCF表達水平Fig.3 c-Kit and SCF expression in small intestine tissue of different vessels fermented Shuidouchi intragastrical mice

2.6 不同容器發酵水豆豉對小鼠小腸中TRPV1、GDNF和NOS的mRNA表達的影響

由圖4可知，對照組小鼠小腸組織中TRPV1、NOS的mRNA表達高于其他組小鼠，但GDNF低于其他組.水豆豉喂養使各組小鼠小腸中的TRPV1、NOS表達低于對照組，而GDNF顯著高于對照組(P<0.05)，使這些表達的強度更為接近正常組小鼠.同時，不同容器發酵的水豆豉對便秘小鼠小腸中的TRPV1、GDNF和NOS表達的影響也具有顯著差異(P<0.05)，GVFS組小鼠小腸的TRPV1、NOS表達低于PVFS和CVFS組小鼠，GDNF高于PVFS和CVFS.TRPV1與吸收和排便有密切關系，激活TRPV1可以引發神經遞質的釋放，導致小腸運動障礙.同時，TRPV1表達增加是腸損傷的重要表現，由于腸道損傷引起腸運動紊亂，便秘狀態下小腸中的TRPV1表達更為強烈[18].GDNF能夠控制神經細胞的生長發育，并保護和修復受損的神經纖維，有助于修復受損的腸道，防止便秘[16].內源性NO廣泛存在于胃腸道，而NOS是NO產生的關鍵酶，NO的大量產生可引起結腸動力障礙，通過控制NOS的表達可以有效地降低NO的含量，從而緩解便秘[19].因此，有效地降低小腸中TRPV1、NOS表達和增強GDNF表達將是控制和緩解便秘的重要手段，而GVFS比其他容器發酵的水豆豉具有更好的上調GDNF和下調TRPV1、NOS表達的能力，從而起到很好的便秘預防和抑制作用.

圖4 不同容器發酵水豆豉灌胃小鼠小腸中TRPV1、GDNF和NOS表達水平Fig.4 TRPV1,GDNF and NOS expression in small intestine tissue of different vessels fermented Shuidouchi intragastrical mice

2.7 不同容器發酵水豆豉中異黃酮的含量(以染料木素計)

對照染料木素標準曲線計算出CVFS、PVFS和GVFS中大豆異黃酮的含量，可以觀察到GVFS中大豆異黃酮的含量最高，PVFS的大豆異黃酮含量也高于PVFS(表4).大豆異黃酮具有抗氧化、擴張血管[20]和促進小腸發育、腸絨毛生長的作用[20]，有利于腸道健康，緩解便秘.由此可見，GVFS中大豆異黃酮含量高于CVFS和PVFS，有可能是GVFS便秘抑制作用強于CVFS和PVFS的原因.

表4 不同容器發酵的水豆豉中大豆異黃酮的含量(以染料木素計)

不同字母表示對應組數據平均值存在顯著性差異(P<0.05).

3 結論

本研究對不同容器發酵水豆豉的便秘預防效果進行了初步研究，通過動物實驗觀察到水豆豉提取物能夠有效地緩解便秘造成的體重喪失，可以有效地加快活性炭水在腸道的通過速度，提高活性炭在小腸中的推進率和減少小鼠排出首粒黑便的時間.通過對血清中相關因子的實驗也證明，水豆豉可以通過提高血清中MTL、Gas、ET、AchE、SP、VIP的水平和減少SS水平來達到緩解便秘的目的.進一步通過RT-PCR實驗分析小鼠小腸中的基因表達，檢測到水豆豉提取物可以上調c-Kit、SCF、GDNF的mRNA表達和下調TRPV1、NOS表達，從而從多個方面抑制便秘的產生.最主要的是雖然不同容器發酵的水豆豉都體現出了抑制便秘的效果，但是相互之間存在顯著差異，玻璃容器發酵的水豆豉具有比陶瓷和塑料容器發酵水豆豉更好的效果.同時，玻璃容器發酵的水豆豉具有比其他容器發酵水豆豉更好便秘抑制作用的機制有可能來源于玻璃容器發酵的水豆豉含有比其他容器發酵水豆豉更多的大豆異黃酮.由此可以得出結論，玻璃容器能夠利于水豆豉的發酵，生產具有預防便秘的功能性水豆豉產品.

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(責任編輯：趙藏賞)

Preventive effects and mechanisms of different vessels fermented Shuidouchi on constipation

FENG Xia1,2,3,4,ZHAO Xin1,2,3,4

(1.Chongqing Collaborative Innovation Center for Functional Food,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China; 2.Chongqing Engineering Research Center of Functional Food,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China; 3.Chongqing Engineering Laboratory for Research and Development of Functional Food,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China; 4.Department of Biological and Chemical Engineering,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China )

The preventive effects and mechanisms of different vessels fermented Shuidouchi ethanol extract on activated carbon induced constipation were researched.After the mice being treated with different vessels fermented Shuidouchi by lavage,it was found that the body weight of control group (activated carbon induced constipation) mice lost weight the most,the gastrointestinal transit rate was lowest,and the first black stool defecation time was longest.The glass vessel fermented Shuidouchi (GVFS) extract could inhibit the mice body weight lost,increase the gastrointestinal transit rate and decrease the first black stool defecation time compared to the control group.Meanwhile,GVFS could raise the mice serum MTL,Gas,ET,AchE,SP,VIP levels and reduce SS level compared to the control group,and these changes of serum levels were significantly stronger than ceramic vessel fermented Shuidouchi (CVFS) and plastic vessel fermented Shuidouchi (PVFS).By the RT-PCR experiment,the results showed that the c-Kit,SCF,GDNF mRNA expressions of GVFS group mice were higher than those of PVFS,CVFS group mice and control group mice,and TRPV1,NOS expressions of GVFS group mice were only higher than the normal group.From these results,Shuidouchi has favorable constipation preventive effects,and the glass vessel fermentation could make the Shuidouchi have better effects,and the main reason might be that GVFS contained high content of soybean isoflavone.

Shuidouchi; vessel; constipation; activated carbon; mice

10.3969/j.issn.1000-1565.2016.06.012

2016-05-01

重慶市工程技術研究中心建設項目(cstc2015yfpt_gcjsyjzx0027)；重慶高校創新團隊建設計劃項目(CXTDX201601040)

馮霞 (1976—)，女，江西宜春人，重慶第二師范學院副教授，主要從事食品營養和功能性食品的研究.E-mail：fengxiacqec@126.com

趙欣 (1981—)，男，重慶人，蒙古族，重慶第二師范學院教授，博士，主要從事食品營養和功能性食品的研究.E-mail：zhaoxin@cque.edu.cn

TS201.4

A

1000-1565(2016)06-0641-09