基于環(huán)介導等溫擴增技術建立的假絲酵母菌快速檢測方法*

林江，溫先勇，林雁，鄧正華，黃遠帥

（西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科，四川瀘州646000）

基于環(huán)介導等溫擴增技術建立的假絲酵母菌快速檢測方法*

林江，溫先勇，林雁，鄧正華，黃遠帥

（西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科，四川瀘州646000）

目的基于環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）建立一種假絲酵母菌的快速檢測方法。方法依據(jù)假絲酵母屬18SrDNA基因保守序列，采用PrimerExplorerV4軟件設計引物，建立LAMP擴增方法和反應體系，對體系的4種關鍵參數(shù)和3項性能指標進行優(yōu)化和探討，并用臨床樣本進行方法驗證。結果6種常見假絲酵母菌LAMP法檢測均為陽性；最適擴增條件為：溫度63～65℃、Bst酶活性4IU、Mg2+濃度4mol/L、擴增時間1h；7種對照菌種及人全血DNA樣本LAMP擴增結果均為陰性；檢測限為102～107CFU/ml。經(jīng)52例臨床樣本驗證，該法敏感性為100%，特異性為95%。結論該研究建立的LAMP假絲酵母菌檢測方法具有實用、簡便、快速、特異和敏感的特點，可為臨床提供一種新的假絲酵母菌診斷方法。

假絲酵母菌；環(huán)介導等溫擴增；檢測方法

近年來，由于廣譜抗生素的使用、侵襲性技術廣泛開展及免疫力低下人群的不斷增加，真菌感染的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，其中常見假絲酵母菌（白色假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌及季假絲酵母菌）感染已占了真菌感染的85%~91%[1]。實驗室常用診斷方法為培養(yǎng)和組織病理學方法，該類方法耗時長、陽性率低、有創(chuàng)性，遠不能滿足臨床需要。環(huán)介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型的核酸擴增技術，近期在細菌和病毒研究領域中發(fā)展迅速，但真菌研究方面的資料卻不多見。為此，本研究根據(jù)LAMP基本原理建立假絲酵母菌快速檢測方法，旨在為臨床快速檢測假絲酵母菌提供一種手段。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株及對照菌株

實驗菌株：白色假絲酵母菌（2.4159）、熱帶假絲酵母菌（2.1028）、近平滑假絲酵母菌（2.4312）、克柔假絲酵母菌（2.3196）、光滑假絲酵母菌（2.3983）、季也蒙假絲酵母菌（2.3204）；對照菌株：大腸埃希菌（1.8732）、金黃色葡萄球菌（1.8721）、銅綠假單胞菌（1.10712）、肺炎克雷伯菌（1.10617），以上菌株由中科院微生物研究所提供；隱球菌、毛霉菌、青霉菌由西南醫(yī)科大學微生物室提供。

臨床樣本：共52份（假絲酵母菌感染樣本32份，非假絲酵母菌感染樣本20份），標本包括為血液、膿液、腦脊液、分泌物等，選取2015年2月-2016年5月西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院血液內(nèi)科、腫瘤科、感染科、ICU病房、新生兒科急門診患者，感染菌種經(jīng)鏡檢、細菌培養(yǎng)、組織病理學、影像學、血清學及臨床資料證實。

1.2 主要試劑與儀器

DNA提取試劑盒（深圳凱杰生物有限公司公司），朗報脫氧核糖核酸擴增試劑盒、朗報熒光目視檢測試劑盒[榮研生物科技（中國）有限公司]，血瓊脂培養(yǎng)基、巧克力選擇培養(yǎng)基、沙保弱培養(yǎng)基（重慶龐通醫(yī)療器械有限公司）。恒溫水浴鍋（成都賽可隆機械設備有限公司），1300seriesA2生物安全柜（蘇州賽摩飛世爾儀器有限公司），高速冷凍臺式離心機（美國THERMO公司），HB-100恒溫金屬浴鍋（杭州博目科技有限公司），C1000梯度PCR擴增儀（美國白樂有限公司），WD-9403L紫外分析儀、DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠）。

1.3 引物設計

針對6種臨床常見假絲酵母菌（白色假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌、季也蒙假絲酵母菌），依據(jù)其18SrDNA基因序列，使用primerexplorer.jp/elamp4.0軟件在線設計LAMP引物，并由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

表1 假絲酵母菌屬LAMP引物序列

1.4 菌株DNA提取

活化冷凍保存（-80℃）菌株恢復培養(yǎng)，將菌株接種至沙保若培養(yǎng)基（血平板），非假絲酵母菌屬源真菌于28℃、假絲酵母（或細菌）于37℃，培養(yǎng)2～5d。挑取一定量的單個純菌落至1.0ml的無菌生理鹽水EP管中。將上述EP管中的菌懸液按10倍倍比稀釋至所需濃度（以平板傾注培養(yǎng)法驗證稀釋后各管濃度并進行濃度調整）。采用凱杰公司DNA提取試劑盒對模板DNA進行提取，操作步驟按說明書嚴格進行。

1.5 LAMP方法的建立及驗證

1.5.1 LAMP擴增體系組成參照榮研產(chǎn)品試劑盒說明書，建立LAMP反應體系（26.0μl）：2×LAMP反應緩沖液12.5μl，4種設計引物（25.0μmol/L的FIP和BIP各1.6μl，5μmol/L的F3和B3各1.0μl），BstDNA聚合酶1.0μl，熒光染料1.0μl，純水補至24.0μl。陰陽性對照反應體系：2×LAMP反應緩沖液12.5μl，BstDNA聚合酶1.0μl，熒光染料1.0μl，2.5μl模板，純水補至24.0μl。實驗組加入已制備的DNA模板液2.0μl，陰陽對照組各加入去離子水和陽性對照液各2.0μl。擴增條件：65℃水浴1h，80℃、5min滅活BstDNA聚合酶終止反應。反應結果用紫外線觀察（或肉眼），陽性顯示為亮綠色熒光，陰性無熒光（橙紅色）。

1.5.2 LAMP方法的驗證利用1.5.1建立的方法對6種假絲酵母菌屬常見菌種進行LAMP擴增后肉眼觀察結果。

1.6 反應體系優(yōu)化

根據(jù)設計引物的理論退火溫度值，選擇溫度（56、59、62、65、68、71、74和77℃）、Bst酶活性（8IU、4IU）、Mg2+濃度（2、4和6mmol/L）及反應時間（30、45、60和90min）等參數(shù)，以白色假絲酵母DNA為模板進行LAMP擴增，以確定最佳反應條件。

1.7 LAMP方法特異性、敏感性及檢測限的檢測

1.7.1 LAMP方法特異性利用建立的LAMP方法對1.1中的6種實驗菌株、4種對照菌株、3種非假絲酵母真菌菌株以及人全血DNA進行LAMP擴增，以評估建立LAMP方法的特異性。

1.7.2 LAMP方法的敏感性及檢測限將白色假絲酵母菌培養(yǎng)，按1.4方法稀釋，制備100～107CFU/m l濃度的菌懸液，以建立的LAMP體系進行擴增，觀察檢測敏感性和檢測限。

1.8 LAMP方法的臨床樣本驗證

對臨床證實的假絲酵母菌感染樣品32份及其他細菌感染樣品20份進行傳統(tǒng)培養(yǎng)和LAMP擴增檢測，比較其陽性率、敏感性及特異性的差異。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。LAMP快速檢測方法采用敏感性、特異性等指標加以評價。

2 結果

2.1 6種常見假絲酵母菌LAMP檢測結果

利用建立的LAMP擴增體系對白色假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌、季也蒙假絲酵母菌等6種假絲酵母菌擴增，熒光觀察見圖1，結果見表2所示，6種常見假絲酵母菌均呈陽性。

2.2 LAMP反應體系優(yōu)化

圖1 6種常見假絲酵母菌LAMP擴增熒光效果圖

表2 6種假絲酵母菌LAMP擴增結果

反應溫度、Bst酶濃度、Mg2+濃度、反應時間等參數(shù)優(yōu)化結果見圖2~5。圖2顯示，在71～77℃內(nèi)產(chǎn)物熒光極弱；在56～68℃溫度范圍內(nèi)熒光明亮，其中在63～65℃熒光強度最強，故確定LAMP擴增適宜溫度為63～65℃。圖3顯示，在最適65℃溫度條件下，Bst酶濃度分別為8 IU、4 IU LAMP擴增熒光觀察結果差異無統(tǒng)計學意義，因成本因素，確定LAMP擴增采用4 IU Bst酶。圖4顯示，在65℃退火溫度和4 IU Bst酶活性條件下，Mg2+濃度分別為2、4和6mmol/L時，以Mg2+濃度為4mmol/L時熒光強度最強。圖5顯示，在65℃，4 IU Bst酶活性、4mmol/L的Mg2+濃度條件下，反應時間分別為30、45、60和90min時，60和90min熒光強度均強，為縮短反應時間，故選擇60min為適宜擴增反應時間。

2.3 LAMP方法的特異性、敏感性和檢測限

2.3.1 LAMP方法特異性6種假絲酵母菌和7種對照菌株及人全血DNA LAMP擴增結果見圖6，其電泳結果見圖7，結果顯示，6種假絲酵母菌及陽性對照均呈陽性；對照菌株、人全血DNA及陰性對照均呈陰性；由于LAMP擴增產(chǎn)物是由多種大小不同片段組成，電泳結果顯示，擴增結果符合LAMP擴增產(chǎn)物特征。

圖2 溫度對LAMP擴增影響熒光效果圖

圖3 Bst酶活性對LAMP擴增影響熒光效果圖

2.3.2 LAMP方法敏感性及檢測限將按1.4方法稀釋、提取的白色假絲酵母菌模板進LAMP擴增，熒光結果（見圖8）顯示，102～107CFU/ml濃度的模板均表達為強熒光，檢測范圍為102～107CFU/ml。見表3。

圖4 Mg2+濃度對LAMP擴增影響熒光效果圖

圖5 反應時間對LAMP擴增影響熒光效果圖

圖6 假絲酵母菌對照菌株及人全血DNALAMP擴增結果

圖7 LAMP特異性檢測電泳效果圖

2.4 LAMP方法的臨床樣本驗證

對經(jīng)臨床證實的32份假絲酵母菌及20份非假絲酵母菌感染樣品分別進行培養(yǎng)和LAMP檢測，其結果見表4。

表4顯示，與傳統(tǒng)培養(yǎng)法比較，LAMP檢測法陽性率（χ2=9.861，P=0.000）和敏感性均有提高（χ2=19.591，P=0.000），檢測時間為1.5～2.0h，也遠遠短于培養(yǎng)法的24～48h。

圖8 LAMP敏感性檢測熒光效果圖

表3 LAMP擴增不同濃度梯度DNA模板檢測結果

表4 臨床樣品培養(yǎng)與LAMP檢測結果比較（n=52）

3 討論

真菌屬于人體正常菌群，當人免疫力降低時容易造成感染，而其中假絲酵母菌占絕大部分[2]。由于該病起病隱匿，早期診斷困難，病情進展迅速，死亡率高[3]，所以臨床上迫切需要一種早期、快速的真菌檢測方法。

LAMP技術是近年來迅速發(fā)展起來的一種分子診斷技術，它依賴于鏈置換酶（Bst酶）在恒溫水浴鍋條件下快速、高效的擴增核酸，具有廣泛的應用前景[4]。

LAMP擴增技術成敗的關鍵是引物設計。由于真核生物核糖體DNA（rDNA）的不同基因和區(qū)段（18 S、28 S、5.8 S、ITS）具有高度保守性，常用于真菌菌屬的鑒定[5-6]。筆者依據(jù)Genbank提供的假絲酵母18S基因保守序列，采用LAMP在線引物設計軟件設計針對假絲酵母屬的外引物F3、B3和內(nèi)引物FIP、BIP等4種特異性引物，經(jīng)過本實驗6種常見假絲酵母菌均能呈現(xiàn)LAMP特異性擴增，而其他細菌如金黃色葡萄球群、肺炎雙球群、銅綠假單胞菌、大腸桿菌及3種非假絲酵母菌屬的真菌（新型隱球菌、毛霉菌）及人全血DNA樣本均未見LAMP特異擴增。

LAMP反應體系中溫度、BstDNA聚合酶、Mg2+濃度、擴增時間等，對擴增都有重要影響：溫度通過影響反應體系酶的活性來影響擴增效率，筆者根據(jù)4種引物的退火溫度范圍，設計了涵蓋56～77℃范圍內(nèi)8個溫度在C1000梯度PCR擴增儀上進行溫度梯度實驗。結果顯示，反應在退火溫度高于70℃時擴增產(chǎn)量低，在退火溫度為63~65℃時擴增產(chǎn)物量最大。由于Bst酶的最佳活性溫度范圍為60～65℃，溫度過高或相對過低都可能影響鏈置換酶活性使擴增產(chǎn)量下降，所以最適溫度應以63～65℃為宜。酶活性的高低可決定反應時間和擴增產(chǎn)物量。Mg2+以dNTP-Mg形式參與核酸骨架相互作用，并且可在一定程度上影響B(tài)st酶的活性，兩者常常相互作用。實驗中根據(jù)Bst酶、Mg2+濃度對擴增效率的影響分別設計8IU、4IU和2、4和6mmol/L的濃度梯度，當Bst酶濃度減半至4IU后與Bst酶8IU的擴增效果差異無統(tǒng)計學意義，Mg2+濃度設置為4mmol/L時，LAMP擴增效率最高。考慮到Bst酶成本，選用Bst酶4IU、Mg2+4mmol/L為反應體系適宜濃度。時間對反應產(chǎn)物量有較大影響。本實驗中設置的4個時間梯度內(nèi)，擴增顯示在30和45min已有較明顯的擴增產(chǎn)物出現(xiàn)，60和90min2個時間段內(nèi)LAMP均出現(xiàn)較強熒光，為了縮短檢測時間，確定適宜擴增時間為60min。

由于4種LAMP引物是針對靶序列6個區(qū)域設計的，在6個區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配時均不能進行核酸擴增，本實驗顯示假絲酵母菌各菌種均能進行特異的LAMP反應，敏感性達到102CFU/ml，與國內(nèi)文獻略有差異[7]，為PCR的10倍。

通過對52份臨床樣品的培養(yǎng)和LAMP檢測證實，除6種實驗假絲酵母菌菌種外，產(chǎn)朊假絲酵母、清酒假絲酵母、馬鈴薯假絲酵母等3種少見的假絲酵母菌菌種也能檢出，而臨床標本中，除7種對照菌種外，其他細菌對檢測干擾很小（僅1例真菌有擴增，與假絲酵母菌基因同源性高），LAMP方法在陽性率、敏感性明顯優(yōu)于培養(yǎng)法。

與其他核酸擴增技術相比，LAMP技術特異、敏感，儀器設備要求低，操作簡單，肉眼可直接觀察，更適合基層醫(yī)療機構開展[8-9]。但由于敏感性高，防污染極為關鍵，否則，可能出現(xiàn)假陽性[6]。其不足之處是只能鑒定到假絲酵母菌菌屬，但已可及時指導臨床對患者的針對性治療。LAMP技術的應用和推廣，為進一步臨床研究和臨床早期確診真菌感染和降低患者死亡率、提高患者預后提供了新的檢測手段。

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（張蕾編輯）

Establishment of loop-mediated isothermal am p lification forrapid detection of candida spp*

Jiang Lin,Xian-yongWen,Yan Lin,Zheng-hua Deng,Yuan-shuaiHuang
(Department of Laboratory Medicine,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,China)

ObjectiveTo establish a rapid detection of candida spp on the basis of loop-mediated isothermal method.MethodsAccording to the gene bank,18 S rDNA gene sequence was provided.Primer Explorer V4 online design software design for the Candida genus-specific primers was used,and LAMP expansion method and the reaction system was set up.Four key parameters for the system and three performance were optimized and discussed, and then verified by clinical samples.ResultsSix kinds of candida were all positive,and the optimum temperature was 63℃-65℃,the activity of Bstwas 4 u,concentration of Mg2+was 4 mM,time was 1 h.All 7 kinds of clinical reference strains and Human whole blood DNA samples amplification results were negative.The detection limitwas 107-102 CFU/ml.A total of 52 cases of clinical samples proved that the method sensitivity was 100%,and the specificity was 95%.ConclusionsThemethod of the genus candida established by LAMP technology is significantly practical,simple,rapid,specific and sensitive.

candida;loop-mediated isothermal amplification;detectionmethods

R-331

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.24.002

1005-8982（2016）24-0006-05

2016-06-21

西南醫(yī)科大學青年科技基金（No：2014QN-102）