淫羊藿苷聯合地塞米松對人髓核細胞增殖及分泌表達的影響

馮仲鍇，孫永強，劉汝銀，岳宗進，王新立

（河南中醫學院第二附屬醫院骨科脊柱病區，河南鄭州450002）

淫羊藿苷聯合地塞米松對人髓核細胞增殖及分泌表達的影響

馮仲鍇，孫永強，劉汝銀，岳宗進，王新立

（河南中醫學院第二附屬醫院骨科脊柱病區，河南鄭州450002）

目的探討淫羊藿苷（ICA）與地塞米松（Dex）聯合作用對人髓核細胞（hNPs）增殖及聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、II型膠原蛋白（Col2a）、IL-6、IL-8和基質金屬蛋白酶（MMP-13）表達的影響。方法取生長狀態良好的hNPs按不同處理因素分為：control組（只含培養基）、ICA組（20μmol/LICA）、Dex組（0.2μmol/LDex）、ICA+Dex組（20μmol/LICA+0.2μmol/LDex）、IL-1β組（10ng/mlIL-1β）、ICA+IL-1β組（20μmol/LICA+10ng/mlIL-1β）、Dex+IL-1β組（0.2μmol/LDex+10ng/mlIL-1β）、ICA+Dex+IL-1β組（20μmol/LICA+0.2μmol/LDex+10ng/mlIL-1β），各組作用48h；CCK-8法檢測細胞的增殖；Westernblot、RT-PCR以及ELISA檢測Aggrecan、Col2a、IL-6、IL-8和MMP-13表達。結果CCK-8結果顯示：與control組比較，低濃度的ICA（≤20μmol/L）和Dex（≤0.2μmol/L）單獨作用均提高hNPs存活率但差異無統計學意義（P>0.05）。然而，10μmol/LICA和0.2μmol/LDex聯合用藥對hNPs的存活率大于單獨用藥（P<0.05）；Westernblot、RT-PCR以及ELISA結果表明：與單獨用藥組相比，ICA和Dex聯合作用促進Aggrecan、Col2a蛋白和mRNA表達（P<0.05）；另外，ICA和Dex聯合處理抑制IL-1β誘導的hNPs炎癥介質IL-6、IL-8的分泌表達（P<0.05），同時降低MMP-13蛋白、mRNA水平（P<0.05）。結論ICA與Dex聯合作用對促進hNPs增殖、Aggrecan和Col2a表達有效果；同時抑制IL-1β誘導的hNPs炎癥介質IL-6、IL-8和MMP-13的表達，為椎間盤退行性病變的藥物治療提供理論依據。

淫羊藿苷；地塞米松；人髓核細胞；聚集蛋白聚糖；II型膠原蛋白；椎間盤退行性病變

椎間盤退行性病變是脊柱外科典型的常見病、多發病，是由椎間盤退變引起的以頸肩腰腿痛為主要表現的一系列臨床綜合征。其機制極其復雜，到目前為止尚不完全清楚，是一個急需解決的醫學難題[1]。促進髓核細胞的增殖，提高蛋白聚糖（Aggrecan）和Ⅱ型膠原蛋白（typeⅡcollagen，Col2a）的含量，抑制炎癥介質的產生，對改善椎間盤退行性病變至關重要[2]。淫羊藿苷（Icariin，ICA）提取于中藥淫羊藿，有強筋壯骨、增強免疫力等作用[3]。研究發現[4]，淫羊藿苷抑制白細胞介素8（Interleukin-8，IL-8）、白細胞介素6（Interleukin-6，IL-6）、Col2a和基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs），從而延緩椎間盤退變過程。地塞米松（Dexamethasone，Dex）是合成的糖皮質激素，具有抗炎、抗過敏、抗休克、免疫抑制等重要生理和藥理作用，已經被廣泛應用[5]。淫羊藿苷和地塞米松在改善腰椎間盤退行性病變方面均有相關報道，然而目前未見二者以及聯合用藥在髓核細胞方面的相關研究。本研究以人髓核細胞（human nucleus pulposus cells，hNPs）為研究對象，探討ICA和Dex聯合用藥對hNPs增殖的影響，以及對hNPs內Aggrecan、Col2a表達、炎癥介質和基質金屬蛋白酶13（MMP-13）的影響。以期為預防、延緩及治療椎間盤退行性病變提高實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

hNPs（sciencell公司），重組人白細胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）（Peprotech公司），胰酶、胎牛血清（FBS）和DMEM/F12培養基（Gibco公司），淫羊藿苷（中國食品藥品檢定研究院），Dex（Sigma公司）；CCK-8試劑盒、RIPA裂解液和BCA試劑盒（上海碧云天公司），硝酸纖維素膜（Bio-Rad公司），Aggrecan、MMP-13和Col2a兔抗（AbcamCambridge公司）及β-actin山羊抗兔二抗（北京博奧森生物技術有限公司），Trizol（Invitrogen公司），TaKaRaPrime-ScriptTMRT-PCRKit（TaKaRa公司），PCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 hNPs培養hNPs用含10%FBS、DMEM/F12培養基（pH7.2），置于37℃、5%二氧化碳的培養箱中孵育。觀察細胞狀態，待生長到80%～90%融合時用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 CCK-8檢測hNPs增殖取生長狀態良好的hNPs，調整細胞濃度，按每孔6.5×103個/150μl密度接種至96孔培養板，邊緣用無菌PBS填充，10~24h后根據不同處理因素將細胞隨機分組：只含培養基組（control）、ICA作用組（ICA）、Dex作用組（Dex）、ICA與Dex作用組（ICA+Dex）。ICA作用組分別用終濃度5、10、20及40μmol/LICA處理hNPs；Dex作用組分別用終濃度0.1、0.2、0.4及0.8μmol/L Dex處理細胞；ICA與Dex作用組用ICA（終濃度10μmol/L）和Dex（終濃度0.2μmol/L）同時處理細胞。每組設5個復孔，每孔200μl，繼續培養48 h加入20μl CCK-8，37℃孵育3 h，充分震蕩10min后，酶標儀于450nm處測吸光值。實驗重復3次，取平均值，細胞活力以control組的百分比表示。

1.2.3 ELISA檢測細胞因子分泌表達水平取生長狀態良好的hNPs，調整細胞濃度，按每孔2.0× 104個/100μl密度接種至24孔培養板，10～24 h后根據不同處理因素將細胞隨機分為兩大組：對照組（control）只加培養基，實驗組（IL-1β組）加入終濃度為10 ng/m l IL-1β，其中IL-1β的濃度參考文獻[17]選定。IL-1β組又根據不同藥物作用分為：ICA+ IL-1β組（終濃度為10μmol/L ICA）、Dex+IL-1β組（終濃度為0.2μmol/L Dex）、ICA+Dex組（ICA終濃度10μmol/L+終濃度0.2μmol/L Dex）處理細胞。每組設4個復孔，每孔600μl，繼續培養48 h收集上清液，按照ELISA試劑盒使用說明書檢測IL-6及IL-8的含量。實驗重復3次，取平均值。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達水平將hNPs細胞（每孔1.5×106個/2ml）接種于6孔板，檢測Aggrecan和Col2a表達的實驗分組及細胞處理與1.2.2完全相同。檢測MMP-13表達的實驗分組及細胞處理與1.2.3完全相同。培養48 h收集各組細胞，用含RIPA裂解液裂解細胞；BCA法測定蛋白濃度并定量；SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉、抗體孵育，利用免疫反應化學發光劑上機檢測蛋白的表達，以β-actin作為內參。其中一抗為Aggrecan（1∶200）、Col2a（1∶500）和MMP-13（1∶500）兔抗抗體（1∶200）；二抗為β-actin辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體（1∶1500）。

1.2.5 RT-PCR檢測mRNA表達水平將hNPs（每孔1.3×106個/2ml）接種于6孔板，實驗分組及細胞處理與1.2.4相同。收集到的細胞用Trizol法提取各組細胞的總RNA，紫外分光光度計檢測提取RNA濃度并純度；將調整至同一濃度的各組總RNA按照TaKaRa逆轉錄試劑盒合成cDNA；然后以cDNA為模板，以β-actin為內參，進行基因片段的擴增，PCR引物見表1。用TaKaRa PrimeScriptTMRT-PCR Kit試劑盒采用兩步法RT-PCR檢測。反應條件：94℃，5min；36個循環（95℃，30 s；60℃，35 s；72℃，50 s）；72℃，終延伸10min。實驗重復3次。根據2-ΔΔCT方法計算基因相對表達水平。

1.3 統計學方法

采用SPSS16.0統計學軟件進行數據處理，數據采用均數±標準方差（±s）表示，采用單因素方差分析和LSD-t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

表1 實時定量PCR引物

2 結果

2.1 人髓核細胞

倒置顯微鏡下觀察hNPs多呈短梭形，胞漿均勻，邊界清楚。其增殖速度適中，貼壁生長較好（見圖1）。

2.2 ICA和Dex聯合用藥對hNPs增殖的影響

CCK-8檢測ICA與Dex單獨及聯合用藥對hNPs增殖的影響，結果顯示：與Control組比較，低濃度的ICA和Dex單獨作用均提高hNPs存活率，但差異沒有統計學意義（P>0.05）（圖2A、B）。為了檢測ICA和Dex聯合作用對hNPs增殖的影響，選取2者促增殖效果最大時對應的藥物濃度，觀察2者聯合作用對hNPs增殖的影響，結果發現，10μmol/L ICA和0.2μmol/LDex聯合用藥時hNPs的存活率高于單獨用藥時存活率（與ICA組比較：P=0.024；與Dex組比較：P=0.032）（圖2C）。

2.3 ICA和Dex聯合用藥對hNPs表達Aggrecan和Col2a的影響

圖1 hNPs（×100）

Western blot及RT-PCR檢測結果顯示，與control組比較，ICA和Dex單獨作用促進Aggrecan和Col2a的mRNA及蛋白表達，差異有統計學意義（ICA組mRNA：PAggrecan=0.029，PCol2a=0.023；蛋白：PAggrecan=0.038，PCol2a=0.039；Dex組mRNA：PAggrecan=0.024，PCol2a=0.027；蛋白：PAggrecan=0.034，PCol2a=0.017）；而ICA和Dex聯合用藥組高于單獨用藥組，差異具有統計學意義（與ICA組比較mRNA：PAggrecan=0.01，PCol2a=0.001；蛋白：PAggrecan=0.011，PCol2a=0.006；與Dex組比較mRNA：PAggrecan=0.03，PCol2a=0.024；蛋白：PAggrecan= 0.029，PCol2a=0.025）。見圖3。

2.4 ICA和Dex聯合用藥對IL-1β誘導hNPs炎癥介質IL-6及IL-8的影響

ELISA檢測結果顯示，IL-6和IL-8在IL-1β組中的表達水平高于control組（PIL-6=0.003，PIL-8= 0.001）；其在ICA組、Dex組及ICA和Dex聯合用藥組的表達水平低于IL-1β組（ICA組：PIL-6=0.047，PIL-8=0.016；Dex組：PIL-6=0.019，PIL-8=0.015；ICA+Dex組：PIL-6=0.006，PIL-8=0.002）；而ICA和Dex聯合用藥組低于單獨用藥組，差異具有統計學意義（與ICA組比較：PIL-6=007，PIL-8=0.003；與Dex組比較：PIL-6=0.005，PIL-8=0.004）。見圖4。

2.5 ICA和Dex聯合用藥對IL-1β誘導hNPs表達MMP-13的影響

Western blot及RT-PCR檢測結果顯示，MMP-13在IL-1β組中的表達水平高于control組，差異具有統計學意義（mRNA：P=0.005；蛋白：P=0.005）；ICA和Dex單獨或聯合作用后IL-1β的表達水平低于IL-1β組（ICA組mRNA：P=0.037；蛋白：P= 0.035；Dex組mRNA：P=0.011；蛋白：P=0.013；ICA+ Dex組mRNA：P=0.004.；蛋白：P=0.005）；同時ICA和Dex聯合用藥組低于單獨用藥組，差異具有統計學意義（與ICA組比較mRNA：P=0.005；蛋白：P=0.000；與Dex組比較mRNA：P=0.006；蛋白：P= 0.006）。見圖5。

圖2 CCK-8法檢測ICA和Dex聯合用藥對hNPs增殖的影響

圖3 ICA和Dex聯合用藥對hNPs表達Aggrecan和Col2a的影響

圖4 ICA和Dex聯合用藥對IL-1β誘導hNPs炎癥介質IL-6及IL-8的影響

圖5 ICA和Dex聯合用藥對IL-1β誘導hNPs表達MMP-13的影響

3 討論

椎間盤退行性病變是一種慢性病變。當退行性病變發生時，椎間盤的成分、結構、功能漸進性被破壞，導致椎間盤高度和脊柱的穩定性改變，進而影響椎間盤生物力學功能，加重小關節和其他結構負擔[6]。近年來，通過藥物治療、物理療法、針灸、推拿、生物治療等手段及時干預退行性病變的諸多環節，維持髓核細胞數量、功能并改善其生存微環境，為扭轉和修復椎間盤退行性病變帶來新希望[7]。

髓核細胞是椎間盤的主要細胞之一，是椎間盤功能的主要執行者。髓核細胞數量的減少以及細胞外基質的丟失進而導致椎間盤發生退行性病變。文獻報道[8]，退行性病變椎間盤中髓核細胞凋亡率[（61.3±24.5）%]比正常椎間盤中髓核細胞凋亡率[（15.5±6.8）%]高出很多；也有研究顯示[9]，Dex可促進髓核細胞增殖，本研究通過CCK-8法也發現了相同的現象。另外，本研究首次發現ICA也可以促進髓核細胞增殖。但是Dex和ICA單獨作用，增殖不顯著，于是本研究將2者聯合處理髓核細胞，發現可以促進增殖。文獻報道，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信號通路與髓核細胞增殖有關[10]。同時，ICA促細胞增殖作用也與MAPK信號通路有關[11]，推測2者促髓核細胞增殖的分子機制也與MAPK信號通路有關。髓核細胞作為椎間盤組織工程的種子細胞，其保持和再植可延緩椎間盤退行性病變[12]，因此，可以考慮采用Dex和ICA 2者聯合作用來治療椎間盤退行性病變。

Aggrecan和Col2a是椎間盤基質內最主要的蛋白基質，主要由髓核細胞分泌表達?；|內的Aggrecan大量結合透明質酸形成富含負電荷、具有彈性和親水性的聚合體。當椎間盤發生退行性病變時，整個椎間盤的含水量下降，Aggrecan含量減少，同時伴有Col1a的增多，Col2a的減少。有學者發現[4]，ICA促進腰椎間盤退行性病變的大鼠模型中Col2amRNA表達，同時Dex可以上調兔髓核細胞中Aggrecan、Col2a的表達[13]。但是，2者在hNPs中的作用沒有研究報道，本研究發現，Dex和ICA單獨作用可促進hNPs Aggrecan和Col2a表達，2者聯合作用效果更顯著，提示Dex和ICA聯合作用將更加有效地改善椎間盤退行性病變。

炎癥因子在椎間盤退行性病變中發揮著重要的作用[14-17]。研究顯示，突出腰椎間盤組織培養液中IL-6含量遠遠高于正常椎間盤組織中的IL-6含量[18]，和IL-6一樣，IL-8也參與椎間盤組織的退行性病變[19]；另外，白藜蘆醇能夠抑制退行性病變椎間盤組織中IL-6和IL-8的異常表達，對阻止頸椎間盤退行性病變具有良好作用[20]。文獻報道[21]，ICA和Dex都可抑制炎癥因子IL-6和IL-8的釋放。但是，2者在髓核細胞中的作用沒有報道，本研究發現，ICA和Dex也可抑制IL-1β誘導hNPs炎癥因子IL-6和IL-8的表達，提示其對椎間盤退行性病變有改善作用。

MMPs是一類具有鋅離子、鈣離子活性的蛋白水解酶家族。其中，MMP-1、8主要降解Ⅲ型膠原和Ⅰ型膠原，MMP-13是Ⅱ型膠原降解酶。MMPs在椎間盤內的表達受到多種因素的調節，其中白細胞介素1（Interleukin-1，IL-1）、IL-6及前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）等炎癥因子可以促進其合成[22-23]。有學者報道，IL-6影響MMP-13/基質金屬蛋白酶抑制劑-1（tissue inhibitor ofmetalloproteinase-1，TIMP-1）的平衡，從而參與椎間盤退行性病變過程[24]。研究發現ICA可降低IL-1β誘導的人軟骨肉瘤細胞MMP-13表達[25]，Dex也可降低MMP-13表達[26]。但是2者以及聯合在hNPs中的作用未見報道，本研究發現2者聯合對IL-1β誘導的hNPs表達MMP-13降低更加明顯，提示ICA和Dex聯合作用可能通過抑制炎癥因子降低MMP-13活性，減緩基質的降解，進而改善椎間盤退行性病變。

綜上所述，ICA和Dex聯合作用可促進hNPs增殖，同時增加Aggrecan和Col2a、mRNA水平的表達。此外，抑制IL-1β誘導的hNPs炎癥介質IL-6、IL-8的分泌表達，降低MMP-13蛋白質、mRNA水平。這些結果均提示ICA和Dex聯合作用對改善椎間盤退行性病變有顯著的效果，然而，其在退行性病變的髓核細胞以及退行性病變椎間盤的動物模型中的研究以及分子機制的探討有待深入研究，以期為改善椎間盤退行性病變提供直接的證據，這也是進一步研究的方向。

[1]許敬人,詹紅生.椎間盤退變機制及中藥對其的干預作用[J].臨床和實驗醫學雜志,2015,14(19):1657-1660.

[2]陳金棟,彭寶淦,高春華,等.炎癥與腰椎間盤退變[J].頸腰痛雜志,2010,31(6):460-462.

[3]TOHDA C,NAGATA A.Epimedium koreanum extractand its constituent icariin improve motor dysfunction in spinal cord injury[J]. Evid Based Complement Alternat Med,2012,2012:731208.

[4]趙飛,王其友.淫羊藿苷對大鼠腰椎間盤退變影響的實驗研究[J].遼寧中醫藥大學學報,2015,17(10):36-38.

[5]MASLANKA T,JAROSZEWSKI J J.In vitro studies on the influence of dexamethasone and meloxicam on bovineWC1+gammadelta T cells[J].Vet Immunol Immunopathol,2013,151(3/4):248-262.

[6]BOXBERGER J I,AUERBACH J D,SEN S,et al.An in vivo model of reduced nucleus pulposus glycosaminoglycan content in the rat lumbar intervertebral disc[J].Spine(Phila Pa 1976),2008, 33(2):146-154.

[7]王鋒,王運濤,吳小濤.髓核細胞修復椎間盤退行性變的研究進展[J].中國修復重建外科雜志,2009,23(7):864-867.

[8]KOHYAMA K,SAURA R,DOITA M,et al.Intervertebral disc cell apoptosis by nitric oxide:biological understanding of intervertebral disc degeneration[J].Kobe J Med Sci,2000,46(6): 283-295.

[9]ABBOTT R D,PURMESSUR D,MONSEY R D,et al.Degenerative grade affects the responses of human nucleus pulposus cells to link-N,CTGF,and TGFbeta3[J].J Spinal Disord Tech,2013, 26(3):E86-94.

[10]鄒隆強,梁偉國.MAKP信號傳導通路在髓核細胞研究進展[J].中國矯形外科雜志,2012,20(21):1963-1965.

[11]陳洋,黃建華,寧友,等.淫羊藿苷藥理作用的分子機制研究進展[J].中西醫結合雜志,2011,11(9):1179-1183.

[12]袁維,王會仁,董健.腰椎間盤髓核組織工程研究進展[J].中國脊柱脊髓雜志,2011,21(2):154-158.

[13]周小銳,劉世清,賀斌,等.地塞米松可影響兔髓核細胞增殖及Ⅱ型膠原的表達[J].中國組織工程研究,2012,16(11):1915-1918.

[14]LEE J M,SONG J Y,BAEK M,et al.Interleukin-1beta induces angiogenesis and innervation in human intervertebral disc degeneration[J].J Orthop Res,2011,29(2):265-269.

[15]LIW,LIU T,WU L,et al.Blocking the function of inflammatory cytokines and mediators by using IL-10 and TGF-beta:a potential biological immunotherapy for intervertebral disc degeneration in a beagle model[J].Int JMol Sci,2014,15(10):17270-17283.

[16]LIANG Q Q,ZHANG M,ZHOU Q,et al.Muscone protects vertebral end-plate degeneration by antiinflammatory property[J]. Clin Orthop Relat Res,2010,468(6):1600-1610.

[17]STUDER R K,VO N,SOWA G,et al.Human nucleus pulposus cells react to IL-6:independent actions and amplification of response to IL-1 and TNF-alpha[J].Spine(Phila Pa 1976), 2011,36(8):593-599.

[18]AL-OBAIDI S,MAHMOUD F.Immune responses following McKenzie lumbar spine exercise in individuals with acute low back pain:a p reliminary study[J].Acta Med Acad,2014,43 (1):19-29.

[19]HOLM S,MACKIEWICZ Z,HOLM A K,et al.Pro-inflammatory,pleiotropic,and anti-inflammatory TNF-alpha,IL-6,and IL-10 in experimental porcine intervertebral disk degeneration[J]. Vet Pathol,2009,46(6):1292-1300.

[20]歐斌,曹奇,陳亮元,等.白藜蘆醇對椎間盤髓核細胞產生IL-6和IL-8的影響[J].中外醫療2013(24):57-58.

[21]陳昊,喬周旻,周超.小劑量地塞米松對膿毒癥大鼠金屬基質蛋白酶9等炎癥因子的影響[J].藥理與毒理,2013,10(23):106-108.

[22]WEI Y,ZHI-HONG W,GUI-XING Q,et al.Extracellular signal-regulated kinase inhibition modulates rat annulus fibrosus cell response to interleukin-1[J].Spine(Phila Pa 1976),2013, 38(17):1075-1081.

[23]KOTHARI P,PESTANA R,MESRAOUA R,et al.IL-6-mediated induction of matrix metalloproteinase-9 is modulated by JAK-dependent IL-10 expression in macrophages[J].J Immunol, 2014,192(1):349-357.

[24]AIDA Y,HONDA K,TANIGAWA S,et al.IL-6 and soluble IL-6 receptor stimulate the production of MMPs and their inhibitors via JAK-STAT and ERK-MAPK signalling in human chondrocytes[J].Cell Biol Int,2012,36(4):367-376.

[25]ZENG L,WANG W,RONG X F,et al.Chondroprotective effects and multi-target mechanisms of Icariin in IL-1 beta-induced human SW 1353 chondrosarcoma cells and a rat osteoarthritis model[J].Int Immunopharmacol,2014,18(1):175-181.

[26]SENDZIK J,SHAKIBAEI M,SCHAFER-KORTING M,et al. Synergistic effects of dexamethasone and quinolones on human-derived tendon cells[J].Int J Antimicrob Agents,2010,35 (4):366-374.

（張西倩編輯）

Effect of icariin in combination w ith Dexamethasone on cell proliferation and secretion expression of human nucleus pulposus cells

Zhong-kai Feng,Yong-qiang Sun,Ru-yin Liu,Zong-jin Yue,Xin-liWang
(Department of Orthopedics,Rachiopathy Ward,Henan Province Hospital of TCM,The Second Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou,Henan 450002,China)

ObjectiveTo investigate the effect of icariin(ICA)in combination with Dexamethasone(Dex)on cell proliferation and secretion expression of Aggrecan,typeⅡcollagen(Col2a),IL-6,IL-8 and MatrixMetalloproteinase-13(MMP-13)in human nucleus pulposus cells(hNPs).MethodsThe experimentwas divided into different groups based on different treatments:control group(only culturemedium),ICA group(20μM/L ICA),Dex group(0.2μM/L Dex),ICA+Dex group(20μM/L ICA+0.2μM/L Dex),IL-1βgroup(10 ng/mL IL-1β),ICA+IL-1βgroup(20 μM/L ICA+10 ng/mL IL-1β),Dex+IL-1βgroup(0.2μM/L Dex+10 ng/mL IL-1β),ICA+Dex+IL-1βgroup (20μM/L ICA+0.2μM/LDex+10 ng/mL IL-1β).Each group was treated for 48 h.Cell proliferation was detectedby CCK-8 assay.The expression levels of Aggrecan,Col2a,IL-6,IL-8 and MMP-13 were examined by Western blotting,RT-PCR and ELISA methods.ResultsICA(20μM/L)or Dex(≤0.2μM/L)at low concentrations promoted hNPs proliferation,but there was no significant difference when compared with the control group(P＞0.05). However,20μM/L ICA in combination with 0.2μM/L Dex significantly increased the cell survival rate of hNPs when compared with the control group,the ICA and teh Dex single treatment group(P＜0.05).The protein and mRNA expression of Aggrecan and Col2a in hNPs were also markedly increased by ICA in combination with Dex when compared with the control group,the ICA and the Dex single treatment group(P＜0.05).In addition,the secretion expression of IL-6,IL-8 and MMP-13 in IL-1β-induced hNPs were significantly inhibited by ICA in combination with Dex when compared with IL-1β,ICA+IL-1βor Dex+IL-1βgroups(P＜0.05).ConclusionsThese findings suggest that icariin in combination with Dexamethasone significantly promotes cell proliferation and the expression of Aggrecan and Col2a in hNPs,and inhibites the secretion expression of IL-6,IL-8 and MMP-13 in IL-1β-induced hNPs,providing a preliminary experimental basis for drug treatment of intervertebral disc degeneration.

icariin;Dexamethasone;hNPs;aggrecan;Col2a;intervertebral disc degeneration

R285.5

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.24.003

1005-8982（2016）24-0011-07

2016-04-11