MicroRNA-124 rs531564、m icroRNA-26A rs7372209和m icroRNA-126 rs4636297多態性與結直腸癌易感性關聯研究

劉劍榮，陳小林

（江西省萍鄉市人民醫院檢驗科，江西萍鄉337055）

MicroRNA-124 rs531564、m icroRNA-26A rs7372209和m icroRNA-126 rs4636297多態性與結直腸癌易感性關聯研究

劉劍榮，陳小林

（江西省萍鄉市人民醫院檢驗科，江西萍鄉337055）

目的探討m icroRNA-124 rs531564（m iR-124 rs531564）、m icroRNA-26A rs7372209（m iR-26A rs7372209）和m icroRNA-126 rs4636297（m iR-126 rs4636297）基因多態性與結直腸癌遺傳易感的關系。方法利用聚合酶鏈式反應-連接酶檢測反應（PCR-LDR）技術，對724例結直腸癌患者和626例健康對照個體的m iR-124 rs531564、m iR-26A rs7372209和m iR-126 rs4636297多態位點進行分型。采用非條件邏輯回歸分析統計該多態位點與結直腸癌易感的相關性，計算相對危險度的比值比（）及95%置信區間（CI）。結果該試驗中m iR-126 rs4636297多態位點，在病例中經調整年齡、性別、吸煙、飲酒等影響相對于CC基因型個體，發現攜帶AG或AA的基因型個體與結直腸癌的患病風險有一定的相關性（P<0.05)，調整后的（95%）分別為[1.289（1.007，1.650）和1.383（0.396，4.834）]。相對于G等位基因，A等位基因顯著提高個體患結直腸癌的風險（=1.307，95%CI=1.054，1.622，P=0.013）；還發現攜帶A等位基因（AG+AA）的個體患結直腸癌風險是攜帶GG基因型個體的1.327倍（AG+AA vsGG，=1.327，95%CI=1.042，1.688，P=0.019）。而m iR-124 rs531564、m iR-26A rs7372209位點的多態性并未發現不同基因型個體與結直腸癌的患病風險相關（P>0.05）。結論m iR-126 rs4636297基因多態性與結直腸癌的遺傳易感有密切關系，攜帶A等位基因可能是促進結直腸癌發病風險的重要因素。

m icroRNA-124；m icroRNA-26A；m icroRNA-126；單核苷酸多態性；結直腸癌；易感性

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是我國腫瘤發病率和死亡率常見惡性腫瘤[1-2]。由于缺乏更為有效的早期診斷、風險評估和預后判斷指標和臨床治療手段，患者5年生存率較低。部分研究表明結直腸癌是環境因素與相關基因共同交互作用的結果。全基因組關聯研究結果揭示相關基因單核苷酸多態性和拷貝數變異及CpG島異常甲基化等都可導致CRC的發生和發展[3-5]，為此CRC相關候選基因的分子和表觀遺傳研究是闡明其發病機制的重要研究方向[6]。而目前已知CRC致病基因的功能異常只能解釋少數臨床病例，而大部分病例精確的分子調控機制尚未闡明。因此，探索相關候選基因與CRC的關系對揭示其精確的分子發病機制、設計合理治療藥物、篩選更為特異有效的臨床診斷和預后判斷指標，以及進一步提高CRC的治療水平具有重要意義。

McroiRNA-124（miR-124）、microRNA-126（miR-126）和microRNA-26A（miR-26A）是近年來在結直腸癌的發病發展過程中新鑒出發揮重要作用的分子[7-9]。上述3個miRNA分子在CRC進展中都發揮抑癌基因作用，筆者推測該miRNA基因可能是CRC潛在的風險易感基因。然而，國內外尚未有見miR-124、miR-126和miR-26A基因遺傳多態性和CRC的關聯研究報道，上述3個基因的遺傳多態性位點與CRC的關系尚不清楚。因此本研究擬通過病例-對照研究，探討以上3個位點的多態性與結直腸癌遺傳易感之間的關系，為結直腸癌的預防和治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2013年9月-2015年9月江西省萍鄉市人民醫院住院結直腸癌患者。對照組人群來自同期萍鄉市人民醫院體檢正常人群。所有病例患者和正常健康個體均為無血緣關系的漢族人群。所有結直腸癌患者均為經組織學病理確診的新發病例，本研究進行的現場面對面調查均征得受試者本人的知情同意。

1.2 基因組DNA提取

問卷調查結束后，經研究對象知情同意，抽提每份樣品均取靜脈血2ml，EDTA-K2抗凝，按照TIAN amp血液基因組DNA提取試劑盒說明抽提外周血基因組，提取的DNA在-80℃冰箱冷凍保存備用，采用PCR-LDR方法對miR-124 rs531564、miR-26A rs7372209和miR-126 rs4636297多態進行基因分型。見表1。

表1 引物序列

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，采用χ2檢驗多態位點的基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡；同時Pearson'sχ2檢驗比較結直腸癌患者與正常對照人群的基因型分布差異；計算比值比（odds ratios，ORs）及其95%置信區間（confidence intervals，CI）分析基因型與結直腸癌發生危險性的關系。所有的統計檢驗均為雙側檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病例組與對照組基本特征因素分布的比較

本次研究總共納入符合標準的結直腸癌患者724例，以及626例健康體檢人群作為對照組（排除腫瘤疾病），并獲得研究對象基因分型數據和完整的基本臨床特征資料。結直腸癌組中最小年齡21歲，最大年齡86歲，平均（56.5±10.8）歲；男性415例，女性309例；健康對照組中最小年齡18歲、最大年齡81歲，平均（53.9±12.7）歲；男性390例，女性236例。兩組在性別、年齡上差異無統計學意義（P>0.05）。結直腸癌組中吸煙、飲酒等情況差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

2.2 3個位點基因型分布及多態性與結直腸癌易感性的關系

2.2.1 M iR-124 rs531564多態性與結直腸癌遺傳易感的關系本研究中CC、CG和GG基因型在結直腸癌組中的頻率分別為71.5%、26.0%和2.5%，在對照組中分別為72.2%、25.6%和2.2%，基因型的分布差異有統計學意義（χ2=6.35，P=0.042）。結果提示，經調整年齡、性別、吸煙、飲酒等影響因素，并未發現攜帶CG或GG的基因型個體與結直腸癌的患病風險相關（P>0.05），調整后的（ 95%）分別為1.026（0.801，1.314）和1.192（0.576，2.470）。而相對于C等位基因，攜帶G等位基因的個體也未降低患結直腸癌的風險=1.049，95%CI：0.848，1.296，P= 0.744]。另有統計結果還說明，并未發現攜帶G等位基因（CG+GG）的個體與結直腸癌的患病風險有相關性（P>0.05），具體數據是（[CG+GG vs CC= 1.043，95%CI：0.821，1.325，P=0.789）]。見表3。

2.2.2 M iR-26A rs7372209多態性與結直腸癌遺傳易感的關系本研究中結直腸癌組718例CC、CT和TT基因型在結直腸癌組中的頻率分別為54.5%、37.3%和8.2%，在對照中分別為53.4%、40.3%和6.3%。結果發現，經調整年齡、性別、吸煙、飲酒等影響相對于CC基因型個體，并未發現攜帶CT或TT的基因型個體與結直腸癌的患病風險相關（P>0.05），調整后的OR（95%）分別為0.914（0.729，1.146）和1.294（0.841，1.991）。而相對于C等位基因，攜帶T等位基因的個體也沒有降低患結直腸癌的風險（=1.025，95%CI：0.863，1.217，P=0.832）。另外并未發現攜帶T等位基因（CT+TT）的個體與結直腸癌患病風險有關聯性（P>0.05），調整后的具體結果為（CT+TTvsCC=0.964，95%CI：0.777，1.196，P= 0.686）。見表4。

2.2.3 MiR-126 rs4636297多態性與結直腸癌遺傳易感的關系本研究中結直腸癌組721例GG、AG和AA基因型在病例中的頻率分別為69.3%、28.3%和2.4%，在對照中分別為75.1%、23.6%和1.3%。經調整年齡、性別、吸煙、飲酒等影響相對于CC基因型個體，發現攜帶AG或AA的基因型個體與結直腸癌的患病風險有一定的相關性（P<0.05），調整后的OR（95%）分別為1.289（1.007，1.650）和1.383（0.396，4.834）。等位基因的相關數據顯示，相對于G等位基因，A等位基因顯著提高個體患結直腸癌的風險（=1.307，95%CI：1.054，1.622，P=0.013），提示A等位基因對宮頸癌的遺傳易感具有損害促進作用。另外統計分析還發現攜帶A等位基因（AG+AA）的個體患結直腸癌的風險是攜帶GG基因型個體的1.327倍（AG+AA vsGG=1.327，95% CI：1.042，1.688，P=0.019）。見表5。

表2 兩組的臨床基線特征比較

表3 MiR-124 rs531564多態性與結腸直腸癌發病風險之間的關聯例（%）

表4 MiR-26A rs7372209多態性與結腸直腸癌發病風險之間的關聯例（%）

表5 MiR-126 rs4636297多態性與結腸直腸癌發病風險之間的關聯例（%）

3 討論

近年來，miRNA自身基因多態性與惡性腫瘤之間的關系開始受到關注，并發現某些miRNA基因SNPs與乳腺癌、肺癌、結腸癌等惡性腫瘤的發病相關[10-12]。內源性或外源性的誘變因素可損傷細胞的DNA，如果損傷不能修復，可能導致程序性細胞死亡或無節制的細胞增殖和腫瘤的發生。雖然miRNA并不編碼蛋白質，但是普遍認為miRNA自身基因上的多態性改變可能會通過影響miRNA的成熟及與下游靶基因的結合等過程，從而調控目的基因的轉錄、表達和生物學功能，從而最終影響個體對不同疾病的易感性及藥物治療的有效性等[13-14]。

MiR-124、miR-126和miR-26A是近年來在結直腸癌發病發展過程中新鑒出發揮重要作用的分子。PKM1/2分子協助HNF4a轉錄因子結合miR-214基因的啟動子區，上調miR-124的轉錄水平，高表達的miR-214可進一步激活線粒體凋亡信號通路促進CRC細胞的凋亡[7]；MiR-124還可以通過與靶基因STAT3基因結合，促進結直腸癌細胞凋亡并降低腫瘤的生長，進而發揮抑癌基因作用，同時miR-124還可調控PRRX1基因的表達提高CRC細胞系對放療的敏感性[17]。MiR-126在CRC組織中低表達，其可調控靶基因IRS-1和CXCR4通過AKT、ERK1/2和RhoA/ROCK信號通路途徑抑制CRC細胞增殖，侵襲和遷移[8]。miR-26a的含量在結腸癌組織中下調，并且miR-26a下調與結腸癌臨床分期、浸潤深度以及淋巴結轉移相關，進而抑制CRC細胞分化、促進其凋亡[9，18]。

本試驗的結果表明，通過對724例患者的miR-126基因rs4636297多態位點與結直腸癌的關系進行分析，結果發現rs4636297中攜帶A等位基因患者的患病風險高于攜帶G等位基因的病例。基因型的分析結果顯示，攜帶基因型AA可增加結直腸癌的患病風險，同時與GG基因型相比，攜帶A等位基因的個體（AG+AA）升高患結直腸癌的易感風險。該結果提示miR-124基因rs531564單核苷酸多態性與廣東地區漢族婦女宮頸癌的遺傳易感有密切關系，G等位基因可能是降低宮頸癌發病風險的一個因素。因此，在調整年齡、性別、吸煙、飲酒等影響因素，攜帶突變基因型AA可增加結直腸癌患病風險，但是未發現miR-124基因RS531564位點和miR-26A基因rs737220位點多態性與結直腸癌易感性存在相關聯系。該結果提示miR-126基因rs4636297單核苷酸多態性與結直腸癌的遺傳易感有密切關系。

有相關的研究已經證實，miRNA-126可以通過與VEGF mRNA中的互補位點進行結合，從而在翻譯水平上抑制VEGF的表達[9，18]。在結直腸癌中表達異常降低或缺失，啟動子區的甲基化修飾是miRNA-126表達降低的重要原因。其研究表明恢復表達miRNA-126可以抑制結直腸癌細胞的遷移和侵襲能力，并且通過抑制腫瘤細胞分泌VEGF而抑制腫瘤血管的生成。這說明結直腸癌中miRNA-126表達的降低或缺失，是造成腫瘤異常高表達VEGF從而促進腫瘤細胞侵襲以及腫瘤血管生成的重要原因。而本研究的結果提示miR-126 rs531564 G等位基因在病例組中的分布頻率低于正常對照組，說明相對于等位基因G，攜帶等位基因A可能是增加結直腸癌發病風險的一個因素。

綜上所述，本研究通過對miR-124 rs531564、miR-26A rs7372209和miR-126 rs46362973個多態位點進行分析，發現miR-126 rs4636297基因多態性與結直腸癌的遺傳易感有密切關系，患者攜帶A等位基因可能是促進結直腸癌發病風險的重要因素之一。而miR-124 rs531564、miR-26A rs7372209兩個位點多態性均未發現與結直腸癌的遺傳易感有密切聯系。由于結直腸癌的發生是一種多基因及多環境因素聯合作用的復雜過程，因此，本研究的實驗結果仍需在不同地區人群和更大樣本中進行驗證，并對其易感機制進行深入研究。

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（張蕾編輯）

Correlation analysis between m iR-124 rs531564、m iR-26A rs7372209 and m iR-126 rs4636297 polymorphisms and susceptibility to colorectal cancer

Jian-rong Liu,Xiao-lin Chen
(Departmentof Laboratory,the People's Hospital of Pingxiang, Pingxiang,Jiangxi337055,China)

ObjectiveTo investigate themiR-124 rs531564,MiR-26A rs7372209 and MiR-126 rs4636297 gene polymorphism and colorectal cancer genetic susceptibility.MethodsPolymerase chain reaction-ligase detection reaction(PCR-LDR)technology was used to detect 724 cases of colorectal cancer patients and 626 healthy control individuals of miR-124 rs531564,MiR-26A RS7372209 and MiR-126 RS4636297 polymorphism point type. Unconditional logistic regression analysis correlationwas used to calculate the relative risk of the statistical ratio of polymorphic lociand colorectal cancer susceptibility ratio()and 95%confidence intervals(CI).ResultsThe test MiR-126 RS4636297 polymorphic loci,in cases adjusted for age,sex,smoking,alcohol consumption and otherfactors with respect to the CC genotype,showed that a certain correlation between the AA or AG genotype and colorectal cancer(P＜0.05),(95%)were adjusted{1.289(1.007,1.650)and 1.383(0.396,4.834)}with respect to the G allele.A allele significantly increased individual risk of colorectal cancer risk(=1.307,95%CI=1.054, 1.622,P=0.013).The study also found that the risk of colorectal cancer for A allele(AG+AA)individuals was 1.327 times of GG genotype(AG+AA vs GG,=1.327,95%CI=1.042,1.688,P=0.019).No correlation between the miR-124 rs531564,MiR-26A rs7372209 polymorphism loci and colorectal cancer risk(P＞0.05).ConclusionsMiR-126 rs4636297 polymorphism and colorectal cancer is closely related to genetic susceptibility, and A allelemight promote the incidence of colorectal cancer important risk factors.

miR-124;MiR-26A;MiR-126;single nucleotide polymorphism;colorectal cancer;susceptibility

R 735.3

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.24.007

1005-8982（2016）24-0033-06

2016-03-15