MUC5AC在Barrett食管及食管腺癌中的表達(dá)及調(diào)控

索文昊 莊嚴(yán)陣 張海萍

MUC5AC在Barrett食管及食管腺癌中的表達(dá)及調(diào)控

索文昊 莊嚴(yán)陣 張海萍

目的 Barrett食管是正常食管向食管腺癌進(jìn)展的重要中間階段，本研究將分析MUC5AC在Barrett食管向食管腺癌進(jìn)展過(guò)程中的作用，及其調(diào)控機(jī)制。方法 通過(guò)分析對(duì)比GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中Barrett食管和食管腺癌基因芯片，尋找差異基因，通過(guò)Western Blot，RealtimePCR等方法檢測(cè)MUC5AC的表達(dá)及P38-MAPK通路對(duì)MUC5AC的調(diào)控機(jī)制。結(jié)果 食管腺癌MUC5AC mRNA水平相對(duì)Barrett食管中的mNRA水平下降86倍，而MUC5AC的表達(dá)受到P38-MAPK通路的調(diào)控，食管腺癌中GRS-1相對(duì)Barrett食管相對(duì)升高17倍，該蛋白抑制了P38活性，下調(diào)了MUC5AC的表達(dá)。結(jié)論 MUC5AC表達(dá)下降是食管腺癌發(fā)生的重要因素，其機(jī)制可能是GRS1抑制P-38活性，通過(guò)MAPK通路下調(diào)MUC5AC表達(dá)，促進(jìn)了Barrett食管向食管腺癌進(jìn)展。

Barrett食管；食管腺癌；MUC5AC；GRS-1；P38；MAPK

Barrett食管（Barrett’s Esophagus，BE）是由于慢性胃食管反流引起食管的腸上皮化生，導(dǎo)致食管下段復(fù)層鱗狀上皮被柱狀上皮代替的病理現(xiàn)象［1］，近年食管腺癌（Esophagus Adenocarcinoma，EA）發(fā)病率逐漸升高，其發(fā)生與Barrett食管關(guān)系密切［2］，Barrett食管成為公認(rèn)的食管腺癌的癌前病變［3］。黏蛋白（Mucin）是覆蓋在上皮組織表面的黏液的主要成分，目前發(fā)現(xiàn)的粘蛋白有20余種，在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，黏蛋白可影響腫瘤細(xì)胞的黏附力、免疫識(shí)別、轉(zhuǎn)移和預(yù)后［4-5］。正常食管粘膜鱗狀上皮表達(dá)MUC1和MUC4，Barrett食管表層柱狀上皮強(qiáng)烈表達(dá)MUC5AC［6］，我們發(fā)現(xiàn)Barrett食管伴有重度異型增生及食管腺癌的上皮中MUC5AC的表達(dá)下調(diào)，但MUC5AC調(diào)控機(jī)制尚不清楚，我們因此推測(cè)由于MUC5AC表達(dá)下調(diào)，Barrett食管無(wú)法獲得保護(hù)，受到長(zhǎng)期刺激后更容易進(jìn)展為食管腺癌。Barrett食管是正常食管向食管腺癌進(jìn)展的重要中間階段，探討其發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制對(duì)臨床防治Barrett食管及阻止其向食管腺癌方向進(jìn)展具有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 GEO數(shù)據(jù)分析

在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）中檢索Barrett食管及食管腺癌，選擇GSE26886［7］進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，該芯片包含正常食管粘膜，Barrett食管及食管腺癌患者的冰凍組織，應(yīng)用Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array進(jìn)行全基因組表達(dá)譜檢測(cè)，我們選取樣本GSM661731，GSM661732，GSM661733，GSM661734，GSM661737，GSM661739為 BE組，選取GSM661743，GSM661745，GSM661749，GSM661752，GSM661753，GSM661756，GSM661758，GSM661761為EA組，利用https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/及http://www.kegg.jp/在線工具進(jìn)行進(jìn)一步分析。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

Barrett食管細(xì)胞系：CP-B細(xì)胞，食管腺癌細(xì)胞BIC-1均購(gòu)自ATCC（American Type Culture Collection），上述細(xì)胞置于含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基中，于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

裂解細(xì)胞后，提取蛋白質(zhì)并定量，制備10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，用P38，P-P38，β-Tublin一抗工作夜（1：1 000稀釋）、HRP標(biāo)記的二抗工作液（1：5 000稀釋）孵育，用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（EC L）顯影并拍照。

1.4 RGS1的干擾與檢測(cè)

針對(duì)RGS1的siRNA干擾序列（見(jiàn)表1）及陰性對(duì)照Scramble序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。將BIC-1細(xì)胞分為對(duì)照組和RGS1干擾組，分別轉(zhuǎn)染Scramble siRNA及干擾siRNA。48 h后提取mRNA，用Realtime PCR檢測(cè)RGS1基因表達(dá)，PCR引物（見(jiàn)表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 RGS1基因的干擾序列和檢測(cè)引物

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間均數(shù)差異性比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）及LSD檢驗(yàn)。P＜0.05，表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析，MUC5AC mRNA在食管腺癌中表達(dá)顯著降低

我們對(duì)GSE26886［7］進(jìn)行分析，對(duì)比EA和BE組mRNA，二者存在差異基因9 670個(gè)（見(jiàn)圖1），其中最為差異最為顯著的10個(gè)基因?yàn)橐?jiàn)表2，其中MUC5AC mRNA 在食管腺癌組織中相對(duì)于Barrett食管mRNA低86倍。

2.2 MAPK通路在Barrett食管和食管腺癌中發(fā)揮了關(guān)鍵作用

通過(guò)分析基于Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)中信號(hào)通路的上下游關(guān)系，構(gòu)建了相關(guān)信號(hào)通路之間的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，我們發(fā)現(xiàn)MAPK信號(hào)通路是BARRETT食管和食管腺癌中最為核心的信號(hào)通路（見(jiàn)圖2）。

2.3 MUC5AC蛋白受到P38-MAPK信號(hào)通路調(diào)控

CP-B和BIC-1分別分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組加入DMSO，而實(shí)驗(yàn)組加入P38抑制劑SB203580（25 μmol/L），通過(guò)Western blot檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)CP-B細(xì)胞和BIC-1細(xì)胞中P38、 P-P38的表達(dá)受到SB203580的抑制，而MUC5AC的表達(dá)也下降（見(jiàn)圖3），說(shuō)明MUC5AC的下調(diào)受到了P38-MAPK信號(hào)通路調(diào)控。

圖1 Barrett食管和食管腺癌mRNA表達(dá)差異基因（Q＜0．05，P＜0．02，倍數(shù)＞1．2）

圖2 基因信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖，B為A局部放大圖，MAPK信號(hào)通路是核心信號(hào)通路

圖3 用DMSO和SB203580分別處理CP-B細(xì)胞和BIC-1細(xì)胞

2.4 RGS1抑制P38-MAPK通路

Barrett食管的發(fā)生通常與反流性食管炎相關(guān)［8］，炎癥刺激會(huì)激活MAPK通路，促進(jìn)激活黏蛋白分泌粘液，但是在食管腺癌發(fā)生過(guò)程中這一過(guò)程被抑制，而調(diào)控機(jī)制尚不清楚，進(jìn)一步分析，我們發(fā)現(xiàn)RGS1參與了該過(guò)程（見(jiàn)表2），食管腺癌組織中RGS1較Barrett食管組升高，我們合成了針對(duì)RGS1基因的干擾序列和PCR引物（見(jiàn)表1），將RGS1 siRNA及對(duì)照siRNA（NC）轉(zhuǎn)染BIC-1細(xì)胞，通過(guò)Realtime PCR方法檢測(cè)，RGS1 RNA表達(dá)下降（見(jiàn)圖4）。

食管腺癌細(xì)胞BIC-1分為3組，分別是WT、NC和siRGS1組，NC組轉(zhuǎn)染Scramble序列，siRGS1轉(zhuǎn)染針對(duì)RGS1的siRNA，轉(zhuǎn)染48 h后提取總蛋白，通過(guò)Western Blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)siRGS1組P38，P-P38，MUC5AC蛋白相對(duì)對(duì)照組升高（見(jiàn)圖5）。

表2 Barrett食管和食管腺癌mRNA表達(dá)差異基因

圖4 食管腺癌細(xì)胞BIC-1轉(zhuǎn)染siRNA，RGS1基因表達(dá)下降注：*表示P＜0．05

3 討論

黏蛋白（Mucin）是覆蓋在上皮組織表面的黏液的主要成分，在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，黏蛋白可影響腫瘤細(xì)胞的黏附力、免疫識(shí)別、轉(zhuǎn)移和預(yù)后［9］。正常食管黏膜鱗狀上皮表達(dá)MUC1和MUC4，而B(niǎo)ARRETT食管表層柱狀上皮強(qiáng)烈表達(dá)MUC5AC，腺體表達(dá)MUC6［6］，我們的研究表明BARRETT食管伴有重度異性增生及食管腺癌的上皮中MUC5AC的表達(dá)下調(diào)，正是這一改變可能使正常的保護(hù)、調(diào)節(jié)黏膜分化的功能受到影響，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

我們的研究發(fā)現(xiàn)P38-MAPK通路是參與MUC5AC調(diào)控的重要信號(hào)通路，P38-MAPK信號(hào)途徑是MAPKs家族中的重要組成部分，是細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)通路的作用途徑之一［10］，它在外界各種刺激條件的作用下，活化為磷酸化P38（P-P38）參與細(xì)胞內(nèi)凋亡、分化、炎癥、應(yīng)激［11-12］等，我們發(fā)現(xiàn)在Barrett食管及食管腺癌細(xì)胞中抑制P38的表達(dá)，MUC5AC表達(dá)水平下降，說(shuō)明MUC5AC受到P38-MAPK通路調(diào)控。Barrett食管的發(fā)生通常與膽汁反流相關(guān)，炎癥刺激常常會(huì)激活MAPK通路，可以通過(guò)激活黏蛋白促進(jìn)細(xì)胞分泌粘液，從而保護(hù)黏膜組織，但是在食管腺癌發(fā)生過(guò)程中這一過(guò)程卻被抑制，通過(guò)分析，我們發(fā)現(xiàn)在食管腺癌中RGS1表達(dá)明顯上調(diào)，該蛋白通過(guò)抑制p38-MAPK通路降低了MUC5AC的表達(dá)，從而使得食管粘膜無(wú)法獲得保護(hù)，在長(zhǎng)期刺激下導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

圖5 BIC-1轉(zhuǎn)染針對(duì)RGS1的siRNA

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Expression and Regulation of MUC5AC in Barrett’s Esophagus and Esophagus Adenocarcinoma

SUO Wenhao ZHUANG Yanzhen ZHANG Haiping
Department of Pathology，The First Affiliated Hospital of Xiamen University，Xiamen Fujian 361003，China

Objective Barrett's esophagus is an important intermediate stage in the development of esophageal adenocarcinoma． In this study，the role of MUC5AC in esophageal adenocarcinoma was analyzed and regulation mechanism of MUC5AC was studied． Methods The differentially expressed genes of Barrett’s esophagus and esophageal adenocarcinoma were performed by analyze microarray in GEO datasets． The expression of MUC5AC expression and the regulation of MUC5AC through P38-MAPK pathway were detected by Western Blot and RealtimePCR． Results The expression of MUC5AC mRNA in esophageal adenocarcinoma was 86-fold lower than that in Barrett's esophagus． The expression of MUC5AC in Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma cells was regulated by P38-MAPK pathway． The expression of GRS-1 in esophageal adenocarcinoma was 17 times higher than that in Barrett's esophagus，the protein inhibited the P38 activity，and down-regulated the expression of MUC5AC． Conclusion The down-regulation of MUC5AC expression is an important factor in the occurrence of esophageal adenocarcinoma． The mechanism may be that GRS1 inhibits P38 activity and down-regulates MUC5AC expression through MAPK pathway，which promotes the progression of Barrett's esophagus to esophageal adenocarcinoma．

Barrett’s esophagus，Esophagus adenocarcinoma，MUC5AC，GRS-1，P38，MAPk pathway

R361

A

1674-9316（2016）23-0165-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2016．23．091

福建省衛(wèi)生計(jì)生委青年科研課題（編號(hào)：2014-2-64）

基金項(xiàng)目：福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：2015J01562）

廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，福建 廈門 361003

▲ 通訊作者：張海萍，E-mail：zhp3398@163．com