慢性應激肝郁脾虛模型大鼠行為學變化及逍遙散調節作用*

河北中醫學院基礎醫學院

王杰鵬 曠湘楠△ 張城浩△ 王少賢 方朝義 趙 丹 申曉日△(石家莊 050200)

慢性應激肝郁脾虛
模型大鼠行為學變化及逍遙散調節作用*

河北中醫學院基礎醫學院

王杰鵬 曠湘楠△張城浩△王少賢 方朝義 趙 丹 申曉日△(石家莊 050200)

目的：研究分析慢性應激肝郁脾虛模型大鼠行為學變化及逍遙散的調節作用。方法:采用捆綁束縛方式建立大鼠模型，60只大鼠隨機平均分為3組，正常對照組、模型組、模型+逍遙散組。觀察各組大鼠一般狀態、體質量、攝食量和曠場、高架十字實驗行為學指標變化。 結果：模型組大鼠在慢性束縛應激初期呈積極抵抗狀態，繼而抑郁，甚或呈絕望狀態；曠場實驗模型大鼠5 min內移動總路程、中央區移動距離均減少；高架十字試驗5 min內模型組大鼠在開放臂內停留時間和進入次數較正常組減少，進入封閉臂次數減少而停留時間增加。說明慢性應激可引起動物探究性自主活動能力下降，隨著應激時間的延長，動物的行為表現逐漸出現郁悶、淡漠、抑郁、焦慮狀態，同時伴隨著大鼠體質量和攝食量較正常組明顯下降；逍遙散則對模型大鼠的上述改變具有一定的調節作用。 結論：逍遙散可在一定程度上改善慢性應激肝郁脾虛模型大鼠的抑郁或焦慮狀態，調節其體質量、攝食量及行為學的異常變化。

逍遙散；慢性應激；肝郁脾虛；行為學；抑郁；焦慮

隨著生活節奏的日益加快，人們承受著越來越多來自工作和生活的壓力，從而導致人們處于一種慢性應激的狀態，亦即亞健康狀態，長此以往，終會導致疾病的發生。中醫學認為，肝主疏泄而調情志，情志疾病的發生多與肝有關。因此，從肝主疏泄而調情志的角度出發，探討分析慢性應激的生理病理學改變，已然成為如今的研究熱點。本實驗以捆綁束縛方式制備慢性應激大鼠模型，動態觀察逍遙散對模型大鼠飲食量、體質量以及行為學的變化，從宏觀角度觀察分析逍遙散對慢性應激的調節作用，為其生理病理學的微觀變化觀察提供模型依據。

1 材料

1.1 實驗動物 雄性SPF級SD大鼠60只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[動物合格證編號：SCXK(京)2012-0001]，體質量160～180 g。飼養于清潔級動物房：室溫(21±1)℃，相對濕度30%～40%，光照明暗各12 h(明7：00～19：00，暗19：00～7：00)，自由飲用純凈水，常規飼養。大鼠適應喂養1周后，按體質量編號，根據隨機數字表，隨機分為3組，正常對照組、模型組、模型+逍遙散組，每組20只。

1.2 實驗用藥及制備 依據《太平惠民和劑局方》所載逍遙散(北柴胡、白芍、當歸、白術各30 g，茯苓、炙甘草各15 g，薄荷、生姜各10 g)制備藥物，藥物飲片購自于北京同仁堂。經河北中醫學院藥學院中藥藥理實驗室鑒定為合格藥材。并由河北中醫學院藥學院中藥藥理實驗室進行藥材的煎煮和濃縮(以成人7倍用藥量)，最終濃縮成濃度為3 g/mL的混懸液。置于4℃保存備用。

1.3 行為學設備

1.3.1 曠場箱：長×寬×高為100×100×40 cm的木制箱。內側面、底面為灰色紙壁，用黑線平均劃分為25塊，每塊面積20×20 cm。中心9格為中央區。曠場箱中央正上方安置攝像頭，觀察記錄大鼠活動情況。

1.3.2 高架十字：由兩條相對的開放臂(45×15 cm) 和兩條相對的封閉臂(45×15×30 cm)以及一個聯結4條臂的中央平臺(15×15 cm)組成，呈十字形。封閉臂頂部開放。內壁及底面為黑色，距地面高度50 cm。在中央平臺正上方安置攝像頭，觀察大鼠活動情況。

1.3.3 行為學記錄分析軟件：由上海欣軟信息科技有限公司提供(Version2.0)。

2 方法

2.1 模型的制備與給藥 根據課題組前期制備模型方法，[1-2]以慢性捆綁束縛方法制備大鼠模型：將大鼠束縛于特制的束縛架上(T型束縛臺：底座寬10 cm、長20 cm、厚2.8 cm，上端束縛臺長22 cm，最寬處6.6 cm，前端有固定頭部的小架和適合四肢放置的凹槽，上端束縛臺有兩條可調的軟帶，可分別將動物胸、腹部固定)，每日3 h，束縛時間點隨機，連續束縛21 d。每天于束縛前30 min進行灌胃。逍遙散組灌服逍遙散混懸液(根據造模前所稱體質量，計算灌胃量為2.98 g/kg·d-1，并根據體質量的變化調整灌胃量)，模型組和正常組灌服同等體積的生理鹽水。

2.2 觀察項目

2.2.1 一般狀態觀察：于每日上午給藥前與束縛造模前后，肉眼觀察動物精神狀態、束縛反應、糞便質地及皮毛、耳廓、眼裂黏膜色澤等外觀表征。

2.2.2 體質量：實驗開始前一天用電子稱稱量大鼠體質量，作為第0 d體質量。實驗開始后每3 d于灌胃前稱量大鼠體質量并記錄，動態觀察各組大鼠的體質量變化趨勢。

2.2.3 攝食量：在正式捆綁束縛開始前一天對各組大鼠進行定食，并于次日稱剩余量，計算攝食量(攝食=定食量-剩余量)，作為第0 d飲食量。正式捆綁束縛后每3 d記錄各組大鼠攝食量，動態觀察各組大鼠攝食量的變化。

2.2.4 行為學觀察：環境要求：安靜、避光，避免干擾。分別于實驗第0(捆綁束縛之前)、7、21天相同時間段進行實驗，用行為學分析軟件進行記錄。每只大鼠實驗完畢后，撿拾糞粒，并用毛巾蘸清水和75%醫用酒精徹底擦拭，待其揮發晾干，避免大鼠留有尿、糞氣味干擾下只動物活動情況。具體的行為學觀測指標包括：各組大鼠5 min在曠場實驗中移動總路程、在中央區移動總路程和停留時間，在高架十字實驗中進入開放臂和封閉臂次數以及停留時間。

3 結果

3.1 各組大鼠一般狀態觀察 束縛造模前，各組大鼠均活潑好動、動作反應靈敏、毛色光白明亮、柔潤整潔、耳廓與爪部色澤紅潤，糞便正常球形、干濕適中。

束縛造模初，正常組大鼠未有明顯改變。模型組和逍遙散組大鼠警惕性增強，在捕捉前扎堆現象比較明顯，易被激惹，捕捉時反抗較為強烈，出現弓背、毛發豎立的狀態，束縛后出現撕咬束縛架、身體強烈扭動掙脫束縛的現象。束縛7 d后，模型組大鼠出現精神萎靡，趴臥少動，甚至嗜睡懶動，動作靈敏度降低，活動量減少，趴臥、蜷臥、扎堆現象多見。皮毛逐漸泛黃干枯、晦暗無澤、散亂不潔，耳廓與爪部顏色變淡白無光澤，舌色淡白，糞便呈濕軟便。捕捉時動作反應不靈敏，反抗不積極，弓背減少。束縛后撕咬、身體扭動掙脫次數減少，呈呆滯狀態。待松開束縛帶，放入籠中后，多數趴臥蜷縮蟄伏于角落。逍遙散組大鼠，最初表現大多同于模型組，但從束縛第2周末開始，各項狀態較模型組好轉，尤其在第3周末，精神狀態良好，反應靈敏，活潑好動，皮毛色可有光澤、稍枯但整潔不亂，耳廓與爪部色淡粉，舌色淡紅，糞便干濕適中，成形尚好。

3.2 各組大鼠體質量、攝食量變化 在束縛應激前，各組大鼠體質量、攝食量之間比較無差別。造模后，模型大鼠在各時間點的體質量、攝食量均較正常組降低，尤其體質量變化明顯(P<0.05或P<0.01)；逍遙散則具有相應的調節作用，尤其在實驗第3、9、18 d體質量較模型組明顯增加(P<0.05或P<0.01)。詳見表1、表2。

時間(d)正常組 模型組 模型+逍遙散組 026507±129026131±74026853±1073329246±162427283±850※29088±1430▲631698±177028894±1083※※30945±1810933655±216530002±1188※※32847±1887▲▲1235322±227131058±1363※※33487±20831536973±243632221±1232※※34318±21091838609±262633202±1255※※35947±2119▲2140185±268534857±1320※※37391±2242

注：與正常組比較，※P<0.05，※※P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

時間(d)正常組 模型組 模型+逍遙散組 02903±4792930±5552940±52333087±1272593±068※※2753±121※※63043±0802490±075※※2700±072※※▲93057±1882550±010※2770±286123087±3812507±282797±133153087±4712543±2112700±050183083±0992510±1002790±502213030±2232493±042※※2783±129

注：與正常組比較，※P<0.05，※※P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

3.3 各組大鼠行為學變化

3.3.1 曠場實驗：各組大鼠5 min在曠場中移動總路程、中央區移動距離和停留時間比較。在曠場實驗中，5 min內模型組大鼠活動的總路程和在中央區移動距離、停留時間，與正常組相比有減少趨勢，尤其是21 d模型組大鼠在中央區的移動距離明顯減少(P<0.01)，逍遙散組大鼠活動的總路程和在中央區移動距離、停留時間較模型組有增加趨勢。詳見表3～表5。

組別0d 7d 21d 正常組430869±85256295747±68956270816±99494模型組377385±109083230532±99797173125±98440模型+逍遙散組398768±96545267871±100281207053±134278

組別0d 7d 21d正常組62521±2567332083±2420551617±23444模型組62126±3149829766±9733 20598±23267※※模型+逍遙散組66368±1520528226±2100924665±16510※※▲

注：與正常組比較，※P<0.05，※※P<0.01; 與模型組比較，▲P<0.05

3.3.2 高架十字實驗：各組大鼠5 min進入開放臂次數和停留時間、進入封閉臂次數和停留時間比較。在高架十字試驗中，5 min內模型組大鼠在開放臂內停留時間、進入次數較正常組有所減少，尤其是21 d模型組大鼠進入封閉臂的次數下降明顯(P<0.05)，逍遙散組大鼠大鼠在開放臂內停留時間、進入次數較模型組大鼠明顯增加(P<0.05或P<0.01)；同時，模型大鼠進入封閉臂次數有所減少，而在封閉臂內停留時間有所增加，21 d模型組大鼠尤其明顯。逍遙散組大鼠與模型組大鼠相比進入封閉臂次數增多，但停留時間減少。詳見表6～表9。

組別0d7d21d正常組3296±7462359±14192934±1732模型組3290±4402059±18631977±1699模型+逍遙散組3123±17322243±22882575±2783

組別0d 7d 21d正常組3042±286551664±21361401±1104模型組2952±2054928±1393540±324模型+逍遙散組2829±20721244±3111967±705▲▲

注：與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

表7各組大鼠5 min進入開放臂次數比較 (n=10，次，

注：與正常組比較，※P<0.05， 與模型組比較，▲P<0.05

組別0d7d21d正常組26330±352631165±575328730±4439模型組26578±527334771±148632641±2522模型+逍遙散組26424±484432120±375728606±9295

表9 各組大鼠5 min進入封閉臂次數比較 (n=10，次，

注：與正常組比較，※P<0.05，※※P<0.01; 與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

4 討論

在本試驗中，筆者采用每天束縛捆綁3 h，連續21 d方法制備慢性應激大鼠模型，主要采用曠場試驗和高架十字迷宮實驗觀察慢性應激大鼠的自主活動狀態以反映動物的情緒狀態變化。

行為的變化可以客觀的反應肌體的生理或病理狀態。曠場試驗(OFT)是目前最常用于測定大鼠情緒、心理狀態的行為學實驗方法，能以量化的指標客觀反映大鼠的活動性、探索性和抑郁、焦慮程度以及對未知的探究欲望，從而提示受試大鼠的情緒狀態；高架十字迷宮實驗[3]是利用動物對新奇環境的探究特性與對高懸敞開臂的恐懼心理，形成動物的矛盾行為。有研究表明，大鼠經慢性應激刺激后會出現一系列情緒性行為改變。[4-6]Kaur R等[7]研究表明，束縛應激可導致大鼠在曠場試驗運行路線和理毛次數等自主活動減少。

結合既往研究結果[8-9]表明，曠場實驗中5 min內模型組大鼠活動的總路程和在中央區移動距離、停留時間，與正常組相比均減少，探究性自主活動能力下降；高架十字試驗中5 min內模型組大鼠在開放臂內停留時間和進入次數較正常大鼠有所減少，進入封閉臂次數有所減少而停留時間有所增加，21 d模型組大鼠尤其明顯。說明慢性應激可引起動物自主行為活動減少，隨著應激時程的延長，動物的行為表現逐漸出現郁悶、淡漠、抑郁、焦慮狀態，同時伴隨著大鼠體質量和攝食量較正常組的明顯下降。

束縛應激方式剝奪了動物的活動自由，與人類心身性疾病的過程有相似性，可見肌體出現抑郁、焦慮等情緒障礙和行為、食欲、體質量異常改變，臨床表現與中醫肝郁致脾虛證候類似。中醫學認為，脾的運化和胃的受納腐熟功能有賴于肝的疏泄功能，“土得木而達”(《素問·寶命全形論》)。一旦肝失疏泄，則木郁乘土，影響脾胃的健運。

在本研究中，筆者選用具有疏肝解郁、健脾養血之功效的逍遙散(《太平惠民和劑局方》)進行干預。作為國內學者抗應激的首選方藥，逍遙散抗應激效應得到了廣泛研究，并取得了階段性成果。[10-13]本實驗的研究結果顯示，應激模型大鼠的體質量、攝食量及外觀表現，與行為學的變化相一致，而逍遙散則具有明顯的調節作用。至于其改善的具體機制，本課題組將著重從下丘腦弓狀核攝食調控相關通路(NPY/AgRP和CART/POMC)進一步研究。

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(2016-07-31 收稿)

Ethological Changes of Chronic Stress Liver-qi and Spleen Deficiency Type Rats and Accomodation of Xiao Yao San

Basic Medical College, Hebei University of Chinese Medicine

WANGJie-pengKuangXiang-nanZHANGCheng-haoWANGShao-xianFANGChao-yi
ZHAODanSHENXiao-ri(Shijiazhuang 050200)

Objective: to study and analyze the ethologhical changes of chronic stress liver-qi and spleen deficiency type rats and the accomodation of Xiao Yao San (XYS). Methods: 60 model rats, made by binding mode, were randomly divided into three groups: control group, model group and model & XYS group，observing the changes of their common states, mass, food consumption, the open field and elevated plus experimental behavior. Results: rats of model group showed a state of active resistance at the early stage of chronic binding stress, and further depression, or even desperation; rats in the open field test had shortened total moving distance and distance in central zone in five minutes; in elevated plus experiment, in five minutes, the residence time in the open arm and entries of the rats reduced compared to control group; time in the closed arm lengthened while the entries reduced. It showed that chronic stress could decrease the animal's exploring ability of independent activities. With the lengthening of stress time, the rats became gloomy, indifferent, depressed and anxious, accompanying with the decreasing of body mass and food consumption significantly; XYS could regulate the changes mentioned above. Conclusion: XYS can in some degree improve the state of depression or anxiety in chronic stress liver-qi and spleen deficiency type rats, regulate the body mass, food consumption and abnormal behaviors.

Xiao Yao San; chronic stress; liver-qi and spleen deficiency; ethology; depression; anxiety

*國家自然基金資助項目：No.81202644、No.81673881；河北省自然科學基金項目：No.H2016423049；2012年度高等學校博士學科點專項科研基金資助課題(新教師類)；No.20121323120016；河北省教育廳高等學校科學研究項目：No.QN2014118

王少賢，女，副教授，醫學博士，碩士研究生導師； 方朝義，男，教授，醫學博士，博士研究生導師。

R285.5

A

1007-5615(2016)04-0007-05

△河北醫科大學中醫學院(石家莊 050017)