血清外泌體對小鼠燙傷創面愈合的影響

謝 正，毛建文

（廣東藥科大學基礎學院細胞生物學與醫學遺傳學系，廣東 廣州 510006）

燙傷是日常生活中一種常見的意外傷害，通常是由于不下心接觸滾燙的液體或金屬所致。尤其是兒童的安全意識較低，更容易接觸一些高溫物體。燙傷過后如果不及時處理燙傷傷口，就很有可能引起皮膚壞死，留下后遺癥。燙傷后形成的硬痂不僅影響活動和外觀，嚴重時甚至可以導致殘疾[1]。

燙傷后，皮膚內部毛細血管破裂，出現紅腫，組織液滲出形成水泡[2]。外泌體因為存在于血液和組織液中，所以可以直接接觸燙傷部位。外泌體是一種直徑為40-100nm的納米級雙分子層囊泡，外泌體由細胞分泌釋放出來，在血液等體液內傳播，幾乎分布于全身各處[3]。外泌體通過攜帶mRNA，MicroRNA和蛋白質等生物活性分子從而介導細胞間通訊，從而發揮多種功能[4-5]。血清是血液的主要成分之一，血清中含有大量的外泌體，而血清中外泌體在燙傷修復中的作用尚未有文獻報道。本研究探討了血清外泌體在小鼠燙傷愈合中的作用及其機理，為燙傷的修復治療提供新的思路。

1 實驗方法

1.1 血清外泌體的提取及鑒定

抽取小鼠血液，靜置1 h，離心2000 g，15 min后分離血清。離心2000 g，30 min去除細胞碎片，轉移至新離心管中，每管分裝1 mL血清。按賽默飛公司外泌體提取試劑盒說明書上的步驟提取外泌體。電子透射顯微鏡觀察外泌體的形態特征。Western blot檢測外泌體的特異性蛋白CD63和HSP70的表達。提取外泌體后，用BCA法測蛋白樣品的濃度后計算蛋白上樣量，SDS-PAGE電泳后轉膜，TBS/T洗三次，用脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBS/T洗三次后加入一抗（CD63，1：1000；HSP70，1：1000），冰箱4 ℃孵育過夜。回收一抗后，TBS/T洗三次，加入相對應的二抗，室溫孵育1 h。TBS/T洗三次，顯影、定影。

1.2 小鼠深II度皮膚燙傷模型的建立及血清外泌體的治療

將體質量為18～22 g的小鼠用10%水合氯醛麻醉后進行背部脫毛和皮膚消毒處理，隨后將小鼠背部貼放在燙傷裝置上進行造模。燙傷裝置由水浴鍋和隔熱木板組成，隔熱木板上設有孔徑為6 mm的圓洞。燙傷溫度和時間后最終確定水浴鍋溫度設置為85℃，燙傷時間為8秒。在每只小鼠背部兩側各燙出一個直徑為6 mm的圓形創面，隨后在小鼠其中一側燙傷部位周邊注射100 μL PBS重懸的外泌體，另一側燙傷部位注射等量PBS，形成自身對照。每只小鼠造模后均單籠飼養。定期觀察小鼠燙傷創面愈合情況。

1.3 MTT實驗

將處在對數生長期的小鼠成纖維細胞以1.5×104個/mL的密度接種于96孔板，每孔100 μL細胞懸液。設4組，每組3個復孔。待細胞完全貼壁后吸棄培養液，PBS洗3次。每孔加入100 μL DMEM培養基。隨后加入3種不同濃度的外泌體懸液，空白組加等量PBS。培養24h后，每孔加入MTT 20 μL，培養箱中孵育4 h，吸棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min后用酶標儀檢測吸光值。

1.4 細胞劃痕實驗

將處于對數生長期的表皮細胞Hacat以25×104個/mL的密度接種于12孔板，每孔1 mL細胞懸液。設2組，每組3個復孔。待細胞貼壁后，用200 μL槍頭在每孔底部中間劃一道細線，吸棄培養液，PBS洗3次。每孔加入1mL DMEM培養基，隨后兩組分別加入外泌體懸液和等量PBS。培養24 h后，在顯微鏡下拍攝細胞遷移情況。

1.5 統計學方法

采用SPSS 20.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料以“±s”表示，采用t檢驗；計數資料以百分數（%），例（n）表示，采用x2檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 外泌體的形態與鑒定

血清外泌體在電鏡下的形態為雙分子層圓形結構。Western bolt結果顯示，外泌體試劑盒提取的血清外泌體可以檢測出特異性標記蛋白CD63和HSP70。

2.2 血清外泌體促進小鼠燙傷皮膚創面的愈合

動物整體實驗顯示，相對于空白對照，血清外泌體能顯著促進小鼠深二度燙傷創面愈合，縮短創面愈合時間。

2.3 血清外泌體對成纖維細胞增殖的影響

MTT結果顯示：不同劑量的血清外泌體作用24 h后，可以促進成纖維細胞的增殖，呈現劑量依賴性。PBS、2 ul Exo、5 ul Exo、10 ul Exo組24 h的OD值分別為（0.630±0.118）、（0.774±0.098）、（1.060±0.087）、（1.174±0.089）。

10 ul/孔濃度的外泌體也呈時間依賴性地促進成纖維細胞的增殖。10 ul Exo組的OD值在0、1、2、3天分別為（0.563±0.084）、（1.110±0.159）、（1.364±0.208）、（1.408±0.159），PBS組的OD值在0、1、2、3 天分別為（0.571±0.076）、（0.731±0.113）、（1.044±0.152）、（1.121±0.136）。

2.4 血清外泌體對表皮Hacat細胞遷移的影響

細胞劃痕實驗顯示：血清外泌體可以顯著地促進Hacat細胞的遷移，外泌體組和PBS組在24 h的遷移率分別為（64.55±4.85）、（33.25±5.35）。外泌體組與PBS處理組的差異具有統計學意義（**P＜0.01）。

3 討 論

雖然外泌體早在在1983年就被發現[6]，但一直未受到人們的重視。然而通過近幾年的研究，人們發現了外泌體在免疫中抗原呈遞[7]、腫瘤的生長與遷移[8]、組織損傷的修復[9]等多個領域的作用。

在燙傷的修復過程中，燙傷的皮膚組織和細胞通常不能靠原來性質的細胞修復，而是由成纖維細胞增生來填補受損的組織，成纖維細胞的增殖對愈合速率有較大的影響。成纖維細胞通過大量增殖，合成和分泌的膠原纖維和基質成分，與新生毛細血管等共同形成肉芽組織，填補缺損壞死組織，為表皮細胞的覆蓋創造條件[10-11]。在燙傷修復的最終階段，隨著硬痂的脫落，表皮細胞的遷移完成覆蓋。

我們的結果證實了血清外泌體能促進成纖維細胞的增殖，并能顯示出量效關系和時效關系，并且本實驗也顯示血清外泌體能促進Hacat細胞的遷移。然而，血清外泌體促進纖維細胞增殖和表皮細胞遷移的機制目前尚未明確，值得進一步的深入探討。本研究采用的是皮下注射給藥，相對于涂抹的給藥方式，不受皮膚通透性的影響。血清外泌體源于血液，相對于傳統燙傷中成藥而言，刺激性小，生物親和性高，不會加重傷口的不適。我們的研究也顯示血清外泌體對燙傷小鼠有較好的療效的同時沒有出現紅腫等排斥現象。

總之，我們的研究發現血清外泌體能促進小鼠燙傷創面的愈合，為臨床皮膚燙傷的治療提供了新的思路。

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