結直腸癌基因治療進展

高兆亞，王延召，雷福明 （北京大學首鋼醫院胃腸外科，北京100144）

結直腸癌基因治療進展

高兆亞，王延召，雷福明 （北京大學首鋼醫院胃腸外科，北京100144）

結直腸癌是一種常見的惡性腫瘤，在全球范圍內造成嚴重的人口和經濟負擔．基因治療是通過運用核酸（DNA或者RNA）治療或者預防人類疾病．近年來，結直腸癌基因治療備受人們青睞，許多研究成果成功運用于臨床．目前結直腸癌基因治療的主要方法有免疫基因治療、自殺基因治療、基因修正治療和溶瘤病毒治療．本文旨在總結結直腸癌基因治療的進展．

結直腸癌；基因治療；癌基因；病毒載體

0 引言

結直腸癌是常見惡性腫瘤，全球每年約有120萬人被診斷為結直腸癌［1］．在中國，結直腸癌發病率不斷上升，2017年國家癌癥中心數據顯示，結直腸癌居于惡性腫瘤發病第五位，死亡率位于第五位［2］．隨著癌癥的早期篩查、外科手術方式的改進以及分子靶向、免疫靶向藥物的出現，結直腸癌的治療水平有了長足的進步［3］．但是晚期結直腸癌的治療不盡人意．新方法的探索為結直腸癌的治療提供了新思路．

腫瘤細胞的生長與凋亡受癌基因與抑癌基因的調控，從而達到一個動態平衡．隨著分子生物學技術和理論的迅速發展以及對腫瘤免疫機制的深入研究，基因治療已逐漸成為一種有希望的新方法．自1990年9月出現世界上首例基因治療試驗，基因治療的研究進展迅速，同時也給結直腸癌的治療帶來新的希望．

1 基因治療

基因治療是從基因水平調控體內癌基因、抑癌基因、癌相關基因的表達，以及利用各種方法導入不同的目的基因，利用基因產物的功能直接或間接治療疾病的治療方法，也就是“以基因作為靶點的治療”．證據表明，基因療法可用于預防、減輕或治愈潛在的疾病，包括癌癥、傳染性疾病、遺傳及自身免疫性疾病［4］．其中超過64%的基因治療是針對實體及血液腫瘤［5］．目前腫瘤的基因治療策略主要有基因修正、自殺基因、免疫基因、溶瘤病毒、基因抑制等．

2 基因修正治療

基因治療的初衷是基因修正，而在腫瘤的治療方面，基因修正治療卻不盡人意．正常功能基因通過載體轉染腫瘤細胞，置換或增補腫瘤細胞缺陷的基因，主要是以病毒為載體把野生型基因重新導入腫瘤細胞．結直腸癌的發生是一個多基因多步驟的過程，它涉及許多癌基因和抑癌基因的激活、失活．當前研究中與結直腸癌密切相關的抑癌基因主要有 p53、MCC、APC、p16等，其中p53是研究熱點．以腺病毒介導的p53表達可明顯抑制細胞分化，并誘導細胞凋亡．

p53以及抑癌基因的研究經過數十年的努力才得以穩步前進，終將帶來癌癥治療領域的新曙光．

3 自殺基因治療

自殺基因治療主要有兩種：前體藥物轉換酶基因治療和毒素基因治療．經典的自殺基因治療是將前體藥物轉換酶基因轉入腫瘤細胞中，該基因表達的生物酶可以使無毒的藥物前體在腫瘤中代謝轉變為有細胞毒性的藥物，從而殺死腫瘤細胞．而毒素基因治療的基礎是毒素基因表達的毒性蛋白干擾細胞膜的穩定性，從而影響腫瘤細胞的生存能力．

前體藥物轉換酶基因有：胞嘧啶脫氨酶、單純皰疹病毒?胸苷激酶（HSV?tk）、細胞色素 P450?2B1、硝基還原酶及其變異．結直腸癌自殺基因治療研究中最廣泛的是胞嘧啶脫氨酶（轉換前提藥物5?氟胞嘧啶（CD／5?FC）和單純皰疹病毒?胸苷激酶（轉換前提藥物丙氧鳥苷 HSV?tk／GCV）．目前研究熱點是通過基因突變或者融合蛋白的方式產生更有效的細胞毒性藥物［6］，或者將自殺基因聯合溶瘤病毒［7］．Yamada等［8］通過表達胞嘧啶脫氨基酶的溶瘤單純皰疹病毒闡述了病毒的復制、基因的表達和前體藥物的活化之間的關系．該研究在小鼠結直腸癌模型上進行，實驗發現，早期加入5?FC相對于晚期加入有更大的細胞毒性；病毒瘤內注射后第6天轉換5?FC成5?氟尿嘧啶（5?FU）的效率最高，治療效果最好．

自殺基因表達毒性蛋白直接作用于腫瘤細胞，這種新的策略逐漸取代前體藥物轉換酶基因治療，成為自殺基因治療的新方法．經典的自殺基因治療僅僅作用于分裂期細胞，破壞DNA合成，而這種新的毒性基因表達的蛋白也可以作用于靜止期腫瘤細胞．Boulaiz等［9］利用逆轉錄病毒為載體攜帶凋亡素基因（apoptin）和鳥苷酸交換因子（gef）轉染 DLD?1 人結直腸癌細胞株，結果顯示同時表達apoptin和gef兩種基因比只表達其中一種基因的病毒載體，更能促進細胞凋亡和抑制細胞活性．

4 免疫基因治療

機體抗腫瘤的免疫主要依賴于腫瘤細胞的抗原被機體免疫系統識別后激活．人類腫瘤免疫原性弱，且抗原呈遞中存在多個環節缺陷，從而使腫瘤出現免疫逃逸．免疫基因治療的主要策略是把腫瘤免疫相關基因導入人體，增強腫瘤的免疫原性以及機體對腫瘤抗原的識別和提呈，以激活有效的免疫應答．

通過輸入細胞因子基因，該基因產物能增強機體免疫功能，使宿主產生有效的抗腫瘤免疫反應．常用 的 細 胞 因 子 有 IL?6［10］、 IL?24［11］、 IL?15［12－13］、IL?12［14］．He 等［15］運用質粒載體將 IL?15 導入到負荷SW480腫瘤細胞小鼠體內．在荷瘤小鼠體內IL?15超表達，抑制腫瘤細胞的生長，同時延長小鼠存活時間．

另一方面，也可通過輸入免疫相關基因刺激機體產生主動免疫功能，達到治療腫瘤的目的．Zhao等［16］使用腺病毒為載體構建表達趨化因子 CCL21和細胞因子 IL?15 基因的病毒 Ad?CCL21?IL?15．在結直腸癌荷瘤小鼠行瘤內注射病毒后能顯著抑制腫瘤生長．另外，經 AdCCL21?IL?15治療后小鼠體內能產生腫瘤特異性細胞毒T淋巴細胞免疫反應，IFN?γ表達水平比對照組高［17］．

重組的基因疫苗常常是表達腫瘤相關抗原裸露的質粒DNA，直接注射到動物體內，使外源基因在活體內表達，產生的抗原激活機體的免疫系統，從而誘導特異性的體液免疫和細胞免疫應答．基因疫苗是近年來基因治療研究中所衍生并發展起來的一個新的研究領域．目前應用較多的腫瘤相關抗原有Her2／neu，MART1，PSA，CEA 等［18］．Parkhurst等［19］通過將鼠源性CEA抗體導入到3例拒絕標準治療的結直腸癌轉移患者體內，3例患者均被觀察到血清CEA水平降低了74%～99%，并且其中1例肝、肺轉移結直腸癌患者生存質量有明顯的提高．研究發現p53在多數腫瘤中是突變狀態，在腫瘤患者中是低免疫原性，這限制其成為抗腫瘤疫苗．

5 溶瘤病毒

溶瘤病毒（oncolytic virus）治療腫瘤是基于病毒選擇性地在腫瘤細胞內大量復制最終破壞腫瘤細胞，釋放子代感染周邊腫瘤細胞，在瘤體內廣泛播散，而對正常組織細胞無殺傷作用［20］．腫瘤細胞裂解后釋放原始抗原和熱休克蛋白，導致強烈的機體抗腫瘤免疫效應．臨床實驗已用多種溶瘤病毒對結直腸腫瘤進行治療，例如腺病毒、單純皰疹病毒、牛痘病毒等［21］．這些病毒不能在正常細胞中復制，而可以選擇性地在腫瘤細胞中復制，通過不斷增殖導致腫瘤細胞的裂解死亡．

Eveno等［22］采用改造的溶瘤痘苗病毒GLV?1h153表達人鈉碘轉運體基因行體外實驗，該病毒能感染復制并溶解人結直腸腺癌細胞．在小鼠結直腸癌腹膜轉移模型上腹腔注射GLV?1h153后，腫瘤顯著減小．NV1020（轉基因溶瘤單純皰疹病毒）Ⅰ／Ⅱ期臨床試驗［23］以轉移性結直腸癌患者為研究對象，Ⅰ期13例患者通過肝動脈注射 NV1020后出現短暫的發熱而無其他不適，試驗證實NV1020是安全的．Ⅱ期入組多線治療后病情仍進展的患者22例，注射 NV1020后，50%患者病情穩定．繼續化療后整體腫瘤控制率為68%，其中部分緩解1例，病情穩定14例，中位生存期延長6．4個月．因此 NV1020在結直腸癌肝轉移患者中具有良好療效且不良反應小．目前，一項NV1020聯合細胞毒性藥物或靶向藥物殺傷腫瘤細胞的大型隨機Ⅱ／Ⅲ期臨床試驗正在開展．

6 基因抑制治療

基因抑制治療主要是干擾基因的轉錄和翻譯，這些基因參與腫瘤的生長、轉移和治療抵抗．miRNA參與多種腫瘤信號通路，控制細胞內穩態，因此，沉默過表達的致癌miRNA以及恢復表達下調抑瘤性miRNA會抑制腫瘤的生長和發展，引起細胞凋亡，降低細胞生存能力［24－25］．

反義基因治療基本機制是通過阻抑從DNA到mRNA的轉錄過程或從mRNA到蛋白質的翻譯過程，沉默過表達的致癌miRNA而阻斷細胞中蛋白質的合成．利用這一技術所研制的藥物稱為反義藥物，通常指反義寡脫氧核苷酸和反義寡核苷酸［26］．反義基因治療概念通俗易懂、設計簡單、費用低，在過去二十年中發展快速．研究［27］發現，反義寡脫氧核苷酸能阻撓結腸癌細胞β?聯蛋白mRNA功能，降低結腸癌胞質內β?聯蛋白表達水平，從而抑制 β?聯蛋白進入核內與轉錄因子結合啟動下游靶基因轉錄．Najar等［28］研究發現 EGFR反義核苷酸能減少 EGFR、MAPK1、STAT5基因表達，降低結直腸癌細胞系的擴增．

另一種基因抑制策略是RNA干擾（RNA interfer?ence，RNAi）．RNAi屬于轉錄后基因沉默機制，其本質是小分子干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）高效特異地阻斷體內同源基因表達，致使mRNA降解，基因表達受抑，是一種序列特異性的轉錄后基因沉默的過程［29］．RNAi技術可以對非正常上調的腫瘤相關基因進行特異性表達抑制，使其處于沉默或休眠狀態，進而達到抑制腫瘤細胞生長的目的［30］．

通過恢復具有腫瘤抑制作用的miRNA來治療結直腸的研究較多，主要通過轉錄miRNA類似物、miRNA前體以及化學修飾的寡核苷酸等來抑制結直腸癌細胞系的腫瘤［31－33］．而以上多數研究結果缺乏體內試驗的證據，有待深入研究．

RNAi可以單獨應用，也可與其他治療手段聯合應用．RNAi正在替代反義核苷酸技術及基因剔除技術在基因功能研究上的地位．基因沉默技術應用于臨床中，首先必須做到精確的靶向沉默，避免脫靶效應，同時必須考慮到基因沉默對機體產生的副作用，例如對正常基因的沉默以及異源性而引起免疫反應等［33］．

7 結語

基因治療在取得一定療效的同時，也存在著基因載體的導入效率低、精確性較差及外源基因在體內表達的可控性差等缺點．目前基因治療多數停留在Ⅰ期臨床試驗階段，很少能進入Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗．隨著定向性傳輸技術、CRISPR／Cas9基因編輯技術、腫瘤精確治療的發展，癌癥治療逐漸進入基因治療的時代．以患者個體基因組基礎，定制個性化精確治療方案將是未來治療腫瘤的終極方法．腫瘤治療之路，任重道遠．

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《Cancer Translational Medicine》約稿函

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文章類型：綜述、原創性論著、假說、薈萃分析、病例報道等．

刊登范圍：癌癥的轉化、臨床、預防、流行病學研究；與癌癥危險因素、發生和發展相關的新通路和新機理的細胞分子水平研究；癌癥表型的新分子機制和相互作用；有關基本原理的獨到見解；具有潛在影響力的概括性總結等．

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《Cancer Translational Medicine》編輯部

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Progress of gene therapy for colorectal cancer

GAO Zhao?Ya， WANG Yan?Zhao， LEI Fu?Ming
Department ofGastrointestinalSurgery， Shougang Hospital，Peking University， Beijing 100144， China

Colorectal cancer（CRC） is one of the most commonly diagnosed cancers in human，posing a serious demographic and economic burden worldwide．Gene therapy involves the use of nucleic acids（DNA or RNA） for the treatment or prevention of human disorders．In recent years， gene therapy for colorectal cancer has attracted much attention，and many research results have been applied in clinic．Currently， the main methods for treating colorectal cancer include immunogene therapy， suicide therapy，gene correction therapy and oncolytic therapy．This article provides a summary of the progress of gene therapy for colorectal cancer．

colorectal cancer； gene therapy； oncogenes； virus vector

R735．3＋7

A

2095?6894（2017）09?55?04

2017－04－27；接受日期：2017－05－10

首都臨床特色應用研究（Z161100000516003）

高兆亞．碩士．研究方向：結直腸癌腫瘤．

E?mail：gzy2082＠ 126．com

雷福明．副教授，主任醫師．研究方向：普通外科．

E?mail：leifuming＠ 126．com