高壓氧對腦白質疏松大鼠的神經保護作用

馮 園， 郭大志， 潘樹義

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高壓氧對腦白質疏松大鼠的神經保護作用

馮 園1,2， 郭大志2， 潘樹義2

目的 探討高壓氧對腦白質疏松大鼠的行為學、海馬結構及神經元影響。方法 采用雙側頸總動脈結扎法制作缺血缺氧腦白質疏松模型，術后2 w腦白質疏松形成。第15天起給予2.0ATA的壓力治療1 h/d，共14 d。定位航行實驗、足跡實驗觀察大鼠行為學變化，HE染色觀察大鼠神經元形態學變化，TUNEL法觀察凋亡神經元情況。結果 與假手術組相比，手術組及高壓氧治療組大鼠認知功能明顯減弱，神經元數量減少,排列疏松,胞核固縮，TUNEL陽性細胞增多;與手術組比較，高壓氧組認知功能有所改善，神經元數量多且排列整齊。TUNEL法測高壓氧組神經元凋亡情況改善。結論 高壓氧可改善腦白質疏松大鼠海馬結構和神經元凋亡情況，且有助于其認知功能的恢復。

腦白質疏松； 高壓氧； 腦白質損傷; 定位航行實驗

高壓氧(Hyperbaric oxygen，HBO)治療是最早由潛水和高氣壓醫學會定義的一種治療方法，指在高于一個大氣壓的加壓艙內呼吸100%純氧的治療過程，也是目前廣泛應用于臨床的一種無創療法。其作用機制主要是通過增加周圍環境中的大氣壓和氧分壓來提高氧分子在組織內的彌散距離，使氧與組織充分接觸，改善微環境[1]。此外，高壓氧還可通過增加傷口周圍的氧梯度加速其愈合，并促進氧依賴膠原蛋白基質形成，進而加快血管新生[2]。Lavrnja等人近期的研究表明,HBO能夠抑制腦損傷后炎癥介質的產生，防止星形膠質細胞活化，減少膠質瘢形成[3]。

腦白質疏松癥(Leukoaraiosis,LA)是一個影像學術語，用于描述腦室周圍及半卵圓中心區腦白質在CT的彌漫性低密度影或MRI T2加權像的高密度影表現，常兩側對稱，病理表現為少突膠質細胞損傷，髓鞘脫失及星形膠質細胞增生等，臨床出現認知障礙和步態異常等癥狀，引起腦白質疏松的原因包括腦外傷、一氧化碳中毒、阿爾茨海默病等，但目前臨床上最為常見的原因是持續低灌注引起的缺血缺氧，長期低灌注致使大腦深部白質發生缺血性脫髓鞘改變，最終造成腦白質疏松。為研究高壓氧治療對腦白質疏松的影響，我們采用de la Torre JC[4]的雙側頸總動脈結扎法，制作缺氧缺血腦白質疏松模型，探討高壓氧治療腦白質疏松的有效性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 (1)動物及分組：2～3 m的Sprague-Dawly雄性大鼠60只，體重200 g左右(由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供)。隨機分為3組：其中包括假手術組(n=20)、手術組(n=20)、HBO治療組(n=20)。(2)器材：單人純氧艙(NG90-ⅢBd 單人醫用高壓氧艙，寧波高壓氧艙總廠生產)，水迷宮(ZS-001 Morris水迷宮，北京眾實迪創科技發展有限責任公司生產)。

1.2 動物模型制備 術前12 h禁食，4 h禁水，用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射，保證術間自主呼吸，大鼠仰臥位固定，頸部備皮，酒精消毒后延頸部正中線做縱行切口，切口約2～3 cm，從胸骨乳突肌和胸骨舌骨肌交界處鈍性分離，暴露雙側頸總動脈與交感神經鏈，玻璃分針剝離交感神經，用4-0號線結扎雙側頸總動脈，1-0號線縫合肌肉和皮膚。傷口消毒后，無菌紗布覆蓋。假手術組僅頸部切開，分離出頸總動脈后不結扎。術后放至37 ℃恒溫箱中，至大鼠蘇醒后放置通風條件良好的動物房飼養。

1.3 HBO治療 雙側頸總動脈結扎14 d后，腦白質疏松形成。此后HBO治療組大鼠行高壓氧治療，治療壓力為2.0 ATA，氧氣洗艙時間10 min，加壓時間15 min，穩壓吸氧60 min，減壓時間15 min，艙內溫度(23.3±2)℃。一次/d，共14次。

1.4 動物行為學實驗

1.4.1 水迷宮實驗 水迷宮實驗主要用于檢測動物的學習記憶能力[5]，各組大鼠造模前訓練3 d，將大鼠頭部朝上，面向池壁放入水中，如果大鼠在60 s內找到平臺，讓其在平臺上停留20 s記憶平臺位置。如果60 s內未找到平臺，用棒將其引至平臺并停留20 s。每只大鼠依次從4個象限的入水點入水中，4個象限完成后擦干，電熱扇保溫后放入籠中。造模完成14 d后，大鼠腦白質疏松形成，術后第15天、第16天、第17天、第21天、第28天行定位航行試驗，將大鼠面壁放入水中，記錄60 s內找到平臺時間，即為逃避潛伏期。若未找到平臺，逃避潛伏期記為60 s，分別從4個象限放入，4個象限的平均值為平均逃避潛伏期。

1.4.2 足跡實驗 自制一U型通道，長寬高分別為60 cm、7 cm、6 cm。通道底部鋪同樣長寬的白紙，大鼠兩前足沾藍色墨汁，兩后足沾紅色墨汁，將大鼠放于通道入口端，記錄通過通道到達另一端時留下的足跡個數，測量總路長，計算平均步長。術后14 d給予高壓氧治療，治療7 d(即術后21 d)、14 d(術后28 d)后分別行足跡實驗。

1.5 取材及HE染色 將行為學實驗后的大鼠麻醉,剪開胸廓，經心臟灌注取腦，4%多聚甲醛固定，梯度脫水后石蠟包埋,行4 μm連續冠狀切片。取相同位置腦片(包含海馬)進行常規HE染色,光學顯微鏡下觀察腦組織形態學變化。

1.6 TUNEL法檢測神經細胞凋亡 TUNEL又稱脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法，是一項用于檢測凋亡細胞的技術。石蠟組織切片，按照試劑盒說明書依次浸洗、染色。光鏡下觀察側腦室旁神經元的凋亡情況，并選取多視野計數凋亡神經元情況。

1.7 統計學分析 采用SPSS 21.0統計軟件，所有計量數據以均數±標準差(χ±s)表示。行為學實驗采用重復測量方差分析進行顯著性檢驗，P<0.05為差異有顯著性意義。TUNEL陽性細胞采用單因素方差分析結合SNK法比較各組間的差異，P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結 果

2.1 水迷宮實驗 假手術組、手術組、HBO治療組進行定位航行試驗，結果顯示，各組隨著訓練次數增加，逃避潛伏期均縮短。與假手術組比較，手術組和HBO治療組平均逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)；術后21～28 d，HBO治療組較手術組明顯縮短(P<0.05)(見表1)。

2.2 足跡實驗 實驗結果顯示，各組在手術前平均步長無差異。術后21 d，與假手術組比較有統計學差異，手術組和治療組動物步態凌亂，步數增加，平均步長顯著縮短。術后28 d，HBO治療組較手術組步伐凌亂得到明顯改善，平均步長較模型組增加，與假手術組相當(見表2)。

2.3 HE染色 光學顯微鏡下觀察海馬CA1區可見，假手術組神經細胞數量較多，排列整齊、緊密，核仁明顯，細胞質染色均勻。手術組神經細胞數量較少，排列疏松，胞核固縮、碎裂或溶解，胞漿周圍可見空暈,胞間距較大。HBO治療組大鼠海馬CA1區神經細胞較手術組數量多，排列較密，染色清晰且固縮變性的神經元較少(見圖1)。

2.4 大鼠神經元凋亡的比較 TUNEL陽性細胞為凋亡的神經元細胞，胞體及細胞核固縮深染，胞核棕黃色，表現出凋亡特征。正常神經元細胞呈藍黑色。光學顯微鏡下觀察大鼠側腦室旁可見，假手術組大鼠側腦室旁只有零星的凋亡神經元；手術組見大量凋亡神經元；HBO治療組凋亡神經元較手術組組明顯減少(見圖2)。

2.5 圖像處理與分析 光鏡下觀察各組切片，采用圖像處理與分析系統分析每張照片，觀察每張切片的5個不同視野，計數每個視野凋亡細胞個數，進行統計學分析。各組大鼠側腦室凋亡神經元數比較，與假手術組相比，手術組與HBO治療組凋亡細胞明顯增多(P<0.05)；與手術組相比，HBO治療組經HBO治療后凋亡細胞減少(P<0.05)。

表1 高壓氧對腦白質疏松大鼠平均逃避潛伏期的影響(單位：s， ±s)

與假手術組相比*P<0.05；與手術組相比#P<0.05

表2 高壓氧對腦白質疏松大鼠足跡測試的影響(單位:cm， ±s)

與假手術組相比*P<0.05；與手術組相比#P<0.05

A:假手術組神經細胞數量較多，排列整齊、緊密，核仁明顯，細胞質染色均勻;B:手術組神經細胞數量較少，排列疏松，胞核固縮、碎裂或溶解，胞漿周圍可見空暈,胞間距較大;C:HBO治療組大鼠海馬CA1區神經細胞較手術組數量多，排列較密，染色清晰且固縮變性的神經元較少

圖1 大鼠海馬CA1區神經元形態(HE染色，×200)

A:假手術組大鼠側腦室旁只有零星的凋亡神經元； B:手術組見大量凋亡神經元；C: HBO治療組凋亡神經元較手術組組明顯減少

圖2 大鼠側腦室旁神經元凋亡比較(TUNEL染色，×200)

3 討 論

腦白質疏松又稱為腦小血管病，是現在公認的腦小血管病理表現[6]，其與動脈粥樣硬化和淀粉樣變是老年性腦改變中最常見的退行性血管疾病。腦小血管病的病理生理機制尚不完全明確，但內皮功能障礙在引起腦小血管缺血方面起著重要作用[7]。在老年人的頭部CT或MRI檢查中經常可以看到腦白質疏松改變，尤其是伴有血管危險因素的老年患者[8]。臨床上常表現為卒中和死亡風險增加及認知能力下降[7]，且認知功能下降和致殘率升高的程度是一致的[9]。腦白質疏松的危險因素包括：年齡、性別、種族、高血壓、糖尿病、抽煙、大血管動脈粥樣硬化、缺血性心臟病、基因等[7]。因腦白質疏松的最重要原因是腦血管供血不足，所以本文采用結扎雙側頸總動脈的方法，模擬大鼠缺血缺氧后低灌注引起的腦白質損害。

HBO治療可明顯提高動脈血氧分壓及氧含量[10,11]，提高機體內氧的攝取，增加氧分子彌散距離。對于創傷性腦損傷，HBO還可減少急性期炎癥因子的產生及抑制神經細胞凋亡[12]，增強血腦屏障的穩定性，降低顱內壓，減輕腦水腫[13,14]。對于腦缺血性損傷，HBO可以顯著減少低氧誘導因子(HIF-1α)及其下游效應蛋白的表達，進而抑制細胞凋亡[15]，還可以顯著改善腦血流量，促進微循環和側枝循環[16]。

海馬在學習記憶過程中發揮著重要作用，有研究表明大鼠雙側頸動脈永久性結扎可引起海馬CA1區神經元減少，且慢性認知功能障礙[17]。本實驗結果顯示水迷宮、足跡實驗等行為學實驗證實術后15～17 d手術組和HBO治療組較假手術組大鼠逃避潛伏期明顯延長(P<0.05);術后21～28 d較實驗結果表明手術組較HBO治療組大鼠逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)，且手術組大鼠足跡紊亂，步長顯著縮短(P<0.05)。手術組較HBO治療組大鼠海馬CA1區HE染色神經元凋亡較多、排列紊亂,與以前的研究結果一致[17]。TUNEL檢測發現HBO治療組較手術組大鼠側腦室旁凋亡神經元減少，證實了HBO治療可減輕神經元凋亡情況。本實驗證明，HBO治療通過抑制海馬區及側腦室旁神經元的凋亡而對腦白質疏松大鼠有神經保護作用。

[1]Harch PG.Hyperbaric oxygen in chronic traumatic brain injury:oxygen,pressure,and gene therapy[J].Medical Gas Research,2015,5(1):1-4.

[2] Gill AL,Bell CN.Hyperbaric oxygen: its uses,mechanisms of action and outcomes[J].QJM: An International Journal of Medicine,2004,97(7):385-95.

[3] Lavrnja I,Parabucki A,Brkic P,et al.Repetitive hyperbaric oxygenation attenuates reactive astrogliosis and suppresses expression of inflammatory mediators in the rat model of brain injury[J].Mediators of Inflammation,2015,1:1-17.

[4]Jc DLT,Fortin T,Park GA,et al.Chronic cerebrovascular insufficiency induces dementia-like deficits in aged rats[J].Brain Research,1992,582(2):186-195.

[5]胡鏡清,溫澤淮,賴世隆,等.Morris水迷宮檢測的記憶屬性與方法學初探[J].廣州中醫藥大學學報,2000,2:117-187.

[6] Pantoni L.Cerebral small vessel disease:from pathogenesis and clinical characteristics to therapeutic challenges[J].Lancet Neurology,2010,9(7):689-701.

[7] Grueter BE,Schulz UG.Age-related cerebral white matter disease (Leukoaraiosis):A review[J].Postgraduate Medical Journal,2011,88(1036):79-87.

[8]Inzitari D,Pracucci G,Poggesi A,et al.Changes in white matter as determinant of global functional decline in older independent outpatients:Three year follow-up of LADIS (leukoaraiosis and disability) study cohort[J].Bm J,2009,339(7715):400-404.

[9] Pantoni L.Leukoaraiosis: from an ancient term to an actual marker of poor prognosis[J].Stroke,2008,39(5):1401-1403.

[10] Matchett GA,Martin RD,Zhang JH,et al.Hyperbaric oxygen therapy and cerebral ischemia:neuroprotective mechanisms[J].Neurological Research,2009,31(2):114-121.

[11]Nemoto EM,Betterman K.,et al.Basic physiology of hyperbaric oxygen in brain[J].Neurological Research,2013,29(2):116-26.

[12] Wang GH,Zhang XG,Jiang ZL,et al.Neuroprotective effects of hyperbaric oxygen treatment on traumatic brain injury in the rat.[J].Journal of Neurotrauma,2010,27(27):1733-1743.

[13]Veltkamp R,Siebing DA,Sun L,et al.Hyperbaric oxygen reduces blood-brain barrier damage and edema after transient focal cerebral ischemia[J].Stroke,2005,36(8):1679-1683.

[14]Calvert JW,Cahill J,Zhang H,et al.Hyperbaric oxygen and cerebral physiology[J].Neurological Research,2007,29(2):132-141.

[15]Sun LH,Marti H,Veltkamp R,et al.Hyperbaric oxygen reduces tissue hypoxia and hypoxia-inducible factor-1 alpha expression in focal cerebral ischemia[J].Stroke,2008,39(3):1000-1006.

[16] Lin S,Liu J,Xin P,et al.Effect of hyperbaric oxygen on cerebral microcirculation and tissue cells in animals with cerebral ischemic injury[J].Space Medicine & mMedical Engineering,1998,11(5):338-342.

[17] Ni J,Ohta H,Matsumoto K,et al.Progressive cognitive impairment following chronic cerebral hypoperfusion induced by permanent occlusion of bilateral carotid arteries in rats[J].Brain Research,1994,653(1-2):231-236.

The neuroprotection effect of hyperbaric oxygen on rats with leukoaraiosis

FENGYuan，GUODazhi，PANShuyi.

(ThethirdClinicalMedicalSchoolofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515，China)

Objective To explore the effect of hyperbaric oxygen on the behavior of leukoaraiosis rat and its hippocampus structure and neurons.Method Established a model of cerebral white matter injure by ligation both of the commom carotid carotid artery combined with hypoxia,the leukoaraiosis formed two weeks ago.From the 15th day,the rats were given 1.6ATA hyperbaric oxygen treatment，one time a day for 14 days.Observed the the behavior changes of rats through the place Navigation experiment and footprint test experiment.HE staining was used to observe the morphological changes of neurons in rat.Apoptosis neurons were observed by TUNEL.Results Compared with the control group,the cognitive function of rat in surgery group and HBO treatment group decreased significantly.The number of neurons decreased,arranged loosely,nucleus pycnosis,TUNEL positive cells increased.Compared with the surgical,HBO group improved cognitive function,neurons increased and rows neat and apoptotic neurons decreased.Conclusion HBO improves hippocampal formation and neuronal apoptosis in leukoaraiosis rats,and was helpful to the recovery of cognitive function.

Leukoaraiosis; Hyperbaric oxygen; White matter impact; Place Navigation experiment

1003-2754(2016)12-1107-04

2016-08-15；

2016-11-30 作者單位：(1．南方醫科大學第三臨床醫學院，廣東 廣州 510515; 2．中國人民解放軍海軍總醫院，北京100048) 通訊作者：潘樹義，E-mail：psy9992011@163.com

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