桑黃水提物抑菌作用的研究與應用

王欽博，楊 焱，齊曉彥

（1乳業生物技術國家重點實驗室，光明乳業股份有限公司，上海 200436；2農業部南方食用菌資源利用重點實驗室，上海市農業科學院食用菌研究所，國家食用菌工程技術研究中心，上海 201403）

桑黃水提物抑菌作用的研究與應用

王欽博1，楊 焱2，齊曉彥1

（1乳業生物技術國家重點實驗室，光明乳業股份有限公司，上海 200436；2農業部南方食用菌資源利用重點實驗室，上海市農業科學院食用菌研究所，國家食用菌工程技術研究中心，上海 201403）

桑黃（Phellinus baumii.）是一種食藥用真菌，利用沸水可提取其子實體抑菌成分。通過選取乳制品中常見的、具有代表性的有害指示菌，研究了不同濃度的桑黃水提物對革蘭氏陽性菌、陰性菌，霉菌和酵母的抑制作用。研究發現：桑黃水提物在1—10 mg/mL作用濃度下，實現了對牛乳中有害細菌、真菌有效的抑制，能顯著控制巴殺牛乳中菌群總數的變化，同時對有益菌無顯著影響，相對Nisin等抑菌劑具有廣譜抑菌性。

抑菌；桑黃；霉菌；酵母；細菌

隨著國民經濟的不斷提高，我國乳品行業已步入了快速發展時期，消費市場對乳制品的品質要求也在不斷提高。開發針對不同消費人群的、具有特殊生理功能的高品質乳制品成為我國乳業發展的一個新方向。而目前國內外乳品微生物污染事故頻發，如2000年日本雪印旗下三款產品檢出金黃色葡萄球菌超標，2002年美國惠氏生產的乳粉被檢出阪崎桿菌超標等［1］。由于乳制品中含有豐富的營養成分，包括蛋白質、脂質、乳糖、維生素等，在乳制品的生產流通以及儲存過程容易受到微生物的污染。因而，抑菌問題成為開發特色高品質乳制品重要的環節之一。

乳制品的抑菌方式主要有內源成分抑菌和外源物質添加抑菌［2］。如目前研究最深、應用最廣的是乳酸鏈球菌肽（Nisin），Nisin能有效地控制食品中的有害細菌［3］，特別是耐熱的芽孢桿菌及梭菌的生長和繁殖，以達到延長不同乳制品貨架期的目的。Nisin能夠有效控制革蘭氏陽性菌的生長繁殖，但對革蘭氏陰性菌、酵母以及霉菌不具有抑制作用［4-5］。因而，與乳制品內源性抑菌物質相比，外源添加抑菌成分有作用范圍小、不具廣譜抑菌性的弊端。開發一種天然、安全的外源抑菌成分應用于乳制品的抑菌具有重要的意義。

桑黃（Phellinus spp.）作為一種珍貴的傳統食藥用真菌，是國際認同的食品領域中相率最高的一種食藥用真菌［6-7］。目前，對于桑黃子實體水提物的生物活性有諸多報道，如抗氧化［8］、抗腫瘤［9］、抗衰老、提高免疫力、抗纖維化、抗肺炎［10-13］等功效。本研究通過研究桑黃子實體水提物的抑菌性，并應用于乳制品，考察桑黃子實體水提物對保鮮乳中菌群總數的影響，旨在為開發一種天然、安全、性能佳的乳制品抑菌劑做部分基礎工作。

1 材料與方法

1．1 原料與儀器

PDA培養基、肉湯培養基購于國藥集團，按藥品說明取固體粉末加去離子水溶解后，121℃滅菌15 min后，待用；MRS培養基、M17培養基購于德國默克公司，按藥品說明取固體粉末溶解后，121℃滅菌15 min后，待用；指示菌：大腸桿菌（Escherichia coli）、宋內氏志賀氏菌（Shigella Castellani）、沙門氏菌（Salmonella）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、青霉（Penicillium candidum）、白霉（Geotrichum candidum）、酵母菌種（Saccharomyces cerevisiae）保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）以及雙歧桿菌（Bifidobacterium），以上菌種保存于光明乳業股份有限公司菌種庫；桑黃（Phellinus baumii.）保存于中國微生物菌種保藏中心上海食用菌分中心。

Bioscreen全自動生長曲線分析儀，購于芬蘭Bioscreen公司；高壓蒸汽滅菌鍋HVE-50，購于HIRAYAMA公司；超凈工作臺TH-CB-402，購于LABCONCO公司。

1．2 桑黃水提物的制備

將桑黃菌種栽培得到子實體后，將子實體粉碎至約1 cm3的顆粒，在干燥的子實體粉碎物中加入20倍體積的去離子水，沸水提取2 h，濾得殘渣進行二次提取；合并兩次提取液并進行濃縮，4 000 r/min離心10 min去除沉淀；將乙醇加入濃縮液中，至乙醇終濃度為90%，室溫下靜置24 h后，將離心后沉淀部分加去離子水溶解，再次離心去除不溶物質；將上清進行透析12 h，透析后溶液進行冷凍干燥，即得桑黃水溶性提取物，115℃滅菌15 min后使用。

1．3 革蘭氏陰性菌抑制試驗

抑菌方法參照ZHAO［14］并稍作改動。取桑黃水提物分別用無菌去離子水配制成0.5 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL、20 mg/mL、50 mg/mL溶液，待用；取大腸桿菌、宋內氏志賀氏菌、沙門氏菌分別進行菌種復蘇后，將菌體接種于液體肉湯培養基37℃下振蕩培養18 h，調節培養后菌液中菌種濃度為105—106個/mL，取1 mL調節后菌液與呈液態的肉湯瓊脂培養基混合均勻后倒至培養皿中；待培養基凝固后，將20 μL不同濃度桑黃水提物溶液滴在混有有害微生物的固體培養基上，以20 μL無菌水作為對照組；37℃下靜置培養48 h后測量平板抑菌圈大小。

1．4 革蘭氏陽性菌抑制試驗

抑菌方法參照ZHAO［14］并稍作改動。取桑黃水提物分別用無菌去離子水配制成0.5 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL、20 mg/mL、50 mg/mL溶液，待用；取單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌以及枯草芽孢桿菌分別進行菌種復蘇，其余步驟參照“1.3革蘭氏陰性菌抑制試驗”。

1．5 霉菌抑制試驗

參照文獻［15］的方法，并略做改動。將滅菌后桑黃水提物與PDA培養基混合均勻，使桑黃水提物終濃度為0.1 mg/mL、1 mg/mL、10 mg/mL，倒入平板凝固后，以空白PDA固體培養基為對照；取青霉、白霉菌株分別進行活化并進行固體擴大培養，7 d后分別挑取青霉、白霉菌種于平板中心，30℃培養7 d后，分別測量青霉、白霉在平板中的直徑。

1．6 酵母生長抑制試驗

取啤酒酵母菌種進行復活，挑取活化后的釀酒酵母擴大培養，調節酵母菌體濃度為105—106個/mL并取180 μL酵母發酵液與20 μL桑黃水提物溶液均勻混合，置于Bioscreen10×10孔板，使樣品終濃度分別為4 mg/mL、20 mg/mL、40 mg/mL，以無菌水作為空白對照，30℃連續震蕩，寬波長于600 nm吸光度，間隔20 min讀數，連續測定2 000 min。

1．7 巴氏殺菌乳菌群總數的控制

將滅菌后的桑黃水提物與新鮮牛乳混合均勻，使樣品在牛乳中的終濃度為0 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL，均質后進行巴氏殺菌，置于10℃下保存，按國標“GB 47892—2010食品安全國家標準”方法測定牛乳中細菌總數，連續測定2周。

1．8 有益菌的影響

抑菌方法參照ZHAO［14］并稍作改動。取桑黃水提物分別用無菌去離子水配制成1 mg/mL、10 mg/mL、50 mg/mL溶液，待用；取保加利亞乳桿菌（MRS培養基）、嗜熱鏈球菌（M17培養基）以及雙歧桿菌（MRS培養基）三種有益菌株復蘇擴大培養，其余步驟參照“1.3革蘭氏陰性菌抑制試驗”。

2 結果與分析

2．1 革蘭氏陰性菌的抑制結果

抑菌圈大小可反映抑菌保護劑抑菌能力，抑菌圈越大，抑菌能力越強（表1）。當不同濃度桑黃水提物作用下，混有有害微生物的平板出現抑菌圈，且抑菌圈隨樣品作用濃度的升高，直徑也不斷擴大；桑黃水提物對志賀氏菌抑制作用較弱，對于大腸桿菌的抑制較為明顯，在1 mg/mL作用濃度下，即對大腸桿菌的生長具有抑制作用。由此可得出結論，桑黃水提物能有效抑制革蘭氏陰性菌生長，但對不同細菌抑制程度有所不同。

表1 不同濃度桑黃水提物對陰性菌的抑制Table 1 The inhibition of gram-negative bacteria after adding aqueous extracts

2．2 革蘭氏陰性菌的抑制結果

不同濃度桑黃水提物作用下，混有有害微生物金黃色葡萄球菌、李斯特菌、藤黃微球菌以及枯草芽孢桿菌的平板均可以觀察到抑菌圈。抑菌作用具有樣品濃度依賴性，隨樣品濃度的升高，抑制作用加強。樣品在低濃度范圍對藤黃微球菌作用不明顯；相對樣品對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌抑制作用較為顯著。

表2 不同濃度桑黃水提物對陽性菌的抑制Table 2 The inhibition of gram-positive bacteria after adding aqueous extracts

2．3 霉菌生長抑制情況

將不同濃度桑黃水提物混入PDA固體培養基，將白霉、青霉菌落置于平板中心，對霉菌生長的抑制作用與霉菌生長圈直徑大小呈負相關（表3）。樣品作用下，霉菌生長圈直徑相對于空白對照縮小，且霉菌生長圈直徑隨著作用劑濃度增大而縮小。10 mg/mL作用濃度下，生長圈直徑分別為空白對照直徑的16.2%、40.6%，因而樣品可有效抑制霉菌的生長。

2．4 酵母生長抑制情況

酵母等微生物在培養液中繁殖都能產生濁度。利用Bioscreen全自動生長曲線分析儀測定酵母生長過程中吸光值的改變，反映其生長速度及菌體濃度等。從圖1可以看出，在桑黃水提物的作用下，對酵母的生長出現了抑制作用，且隨作用濃度的升高，最大吸光值越小，酵母生長周期最高菌體濃度越低。

表3 不同濃度桑黃水提物對霉菌生長的抑制作用Table 3 Different concentrations of aqueous extracts of inhibition for the growth of mold

2．5 巴殺保鮮乳中菌群生長抑制情況

隨著桑黃水提物濃度的提高，保存相同時間的保鮮牛奶乳中菌群總數越低，10 mg/mL作用濃度下，10℃保存14 d的巴殺鮮乳菌群總數最高未超過2×104cfu/mL?？梢姡｜S水提物能有效控制保鮮牛奶乳中菌群總數，起到延長貨架期的作用。

圖1 不同濃度桑黃水提物對酵母生長的抑制作用Fig．1 Different concentrations of aqueous extracts of inhibition for the growth of yeast

圖2 不同濃度桑黃水提物對細菌生長的抑制作用Fig．2 Different concentrations of aqueous extracts of inhibition for the growth of bacteria

2．6 有益菌生長作用情況

選取乳制品中常見有益菌進行試驗，保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌并沒有產生可見的抑菌圈，只有在濃度較高時才在雙歧桿菌平板上觀察到較小的抑菌圈（表4），所以本發明的抑菌保護劑對有益菌無顯著抑制作用。

表4 桑黃水提物對有益菌的作用Table 4 The influence of different concentration aqueous extracts of probiotics

3 結論與討論

由于不同乳制品中成分較為復雜，添加菌種類別、奶源成分比例、加工方式、生產設備等均存在差異，因此很難用統一的抑菌方法應用到乳品企業生產中。目前多數乳品企業通過改變生產工藝、提高原奶的品質來達到延長貨架期的目的，現有澳大利亞乳企將巴氏殺菌乳從原有21 d保質期，通過生產工藝改造將貨架期延長至45 d。另有乳企通過添加天然、安全的抑菌成分的方式，延長保鮮乳制品的貨架期，但目前食品標準允許添加的抑菌成分較少，且不具有廣譜抑菌性。應當尋求多種保鮮技術的協同作用的方式，以達到抑制乳制品中有害微生物生長的目的。

本試驗以食藥用真菌桑黃（Phellinus baumii.）子實體為研究對象，使用沸水提取的方法，提取子實體中具有抑菌性的物質。研究分析了該水提物抑菌特性，分別選取了乳制品中具有代表性常見的幾類微生物進行抑菌試驗。桑黃子實體水提物對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、霉菌以及酵母均有不同程度的抑制作用。對大腸桿菌等革蘭氏陰性菌，在1 mg/mL作用濃度時表現出了抑菌性質，但對志賀氏菌作用不明顯；對于金黃色葡萄球菌等陽性菌，抑制效果較佳，在較低濃度0.5 mg/mL作用濃度下，即對部分陽性菌表現抑菌活性。酵母、霉菌是乳制品生產、運輸、存放方程中，常見微生物污染源，本研究中考察了在桑黃水提物不同作用濃度下，有效抑制了酵母和霉菌的生長，一定程度上延長了保鮮牛乳的貨架期。另外，本研究發現，桑黃水提物對牛乳中有益菌的影響除在50 mg/mL高濃度作用下，對雙歧桿菌出現輕微抑制現象，但對保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌不存在顯著抑制作用。因此，1—10 mg/mL桑黃水提物在不抑制有益菌生長的前提下，實現了對牛乳中有害細菌、真菌有效的抑制，能顯著控制巴殺牛乳中菌群總數的變化，相對Nisin等抑菌劑具有廣譜抑菌性。

［1］李莎.乳制品中乳酸菌檢測不確定性及鮮奶保鮮技術研究［D］.長沙：湖南農業大學，2013.

［2］王欽博，杭鋒，穆海菠，等.乳制品抑菌方法研究與進展［J］.上海農業學報，2015，31（4）：151-156.

［3］DELVES B J.Nisin and its uses as a food preservative［J］.Food Technol，1999，44（3）：100-117.

［4］HITCHINS A D，GOULD G W，HURST A.The swelling of bacterial spores during germination and outgrowth［J］.Gen Microbiol，1963，30：445-453.

［5］呂淑霞，白澤樸，代義，等.乳酸鏈球菌素（Nisin）抑菌作用及其抑菌機理的研究［J］.中國釀造，2008（9）：87-91.

［6］南京中醫藥大學.中藥大辭典［M］.2版.上海：上?？茖W技術出版社，2006：2784-2785.

［7］IKEKAWA T，NAKANISHI M，UEHARA N，et al.Antitumor action of some basidiomycetes，especially Phellinus linteus［J］.Gann，1968，59：155-157.

［8］胡金霞，楊焱，張勁松，等.桑黃醇提物抗氧化和保護神經細胞損傷的研究［J］.上海農業學報，2009，25（2）：58-61.

［9］郝瑞霞，周帥，楊焱，等.不同來源的桑黃子實體醇提物中黃酮含量及生物活性的比較［J］.食用菌學報，2008.15（2）：23-26.

［10］HUR J M，YANG C H，HAN S H，et al.Antibacterial effect of Phellinus linteus against methicillin-resistant Staphylococcus aureus［J］. Fitoterapia，2004（75）：603-605.

［11］KIM S H，SONG Y S，KIM S K，et al.Anti-inflammatory and related pharmacological activities of the n-BuOH subfraction of mushroom Phellinus linteus［J］.Journal of Ethnopharmacology，2004，93：141-146.

［12］SONG T Y，LIN H C，YANG N C，et al.Antiproliferative and antimetastatic effects of the ethanolic extract of Phellinus igniarius（Linnearus：Fries）Quelet［J］.Journal of Ethnopharmacology，2008，115：50-56.

［13］KIM H M，KANG J S，KIM J Y，et al.Evaluation of antidiabetic activity of polysaccharide isolated from Phellinus linteus in non-obese diabetic mouse［J］.International Immunopharmacology，2010，10：72-78.

［14］ZHAO Z，MA Y，DAI C，et al.Imcroporin a new cationic antimicrobial peptide from the venom of the scorpion Isometrus maculates［J］. Antimicrob Agents Chemother，2009，53：3472-3477.

［15］王開金，李寧，陳列忠，等.加拿大一枝黃花精油的化學成分及其抗菌活性［J］.植物資源與環境學報，2006，15（1）：34-36.

（責任編輯：張睿）

Study and application of aqueous extract from Phellinus baumii on antibacterial activities

WANG Qin-bo1，YANG Yan2，QI Xiao-yan1（1State Key Laboratory of Dairy Biotechnology，Bright Dairy＆Food Co.，Ltd，Shanghai 200436，China；2National Engineering Research Center of Edible Fungi，Institute of Edible Fungi，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201403，China）

Phellinus sp.is a highly-valued medicinal mushroom.Antimicrobial constituents were extracted through the boiling water.The typical harmful indicators bacteria existed in dairy products were selected.The different concentrations of the sample were studied in the bacteriostatic action of bacteria，yeast and mildew.The results showed that the Phellinus baumii aqueous extracts restrained the growth of harmful bacteria，mold and yeast in milk effectively under the 1—10 mg/mL concentrations.The total numbers of bacteria in milk were effectively controlled.At the same time there was no harm to the beneficial bacteria，the sample has a broad spectrum antimicrobial resistance compared with Nisin.

Phellinus baumii；Antibacterial activity；Yeast；Mildew；Bacterium

S567.3

A

1000-3924（2016）06-064-05

2015-12-01

十二五科技支撐計劃課題（2012BAD28B07）新型乳制品的研發與產業化示范

王欽博（1984—），男，碩士，工程師，從事乳制品發酵劑及活性研究。E-mail：wangqinbo524＠163.com