小鼠在柯薩奇病毒A組16型活病毒免疫原性評價中的應用

孟華清, 楊 婷, 謝天宏, 李 華, 岳 磊, 宋 霞, 張 也, 謝忠平

(中國醫學科學院/北京協和醫學院醫學生物學研究所云南省重大傳染病疫苗工程技術研究中心,云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室，昆明 650118）

·論 著·

小鼠在柯薩奇病毒A組16型活病毒免疫原性評價中的應用

孟華清, 楊 婷, 謝天宏, 李 華, 岳 磊, 宋 霞, 張 也, 謝忠平

(中國醫學科學院/北京協和醫學院醫學生物學研究所云南省重大傳染病疫苗工程技術研究中心,云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室，昆明 650118）

目的 評價小鼠在柯薩奇病毒A組16型(CA16)活病毒感染中免疫原性的應用，為減毒活疫苗研究提供實驗數據。方法 以不同劑量的CA16活病毒通過皮下、腹腔和肌肉途徑接種不同年齡的ICR和BALB/c小鼠，采集初次免疫7 d、21 d、28 d以及加強免疫7 d后的血樣; 通過微量細胞病變中和法檢測中和抗體效價, 細胞因子ELISA檢測試劑盒檢測6種細胞因子含量。結果 初次免疫后28 d，肌肉、腹腔和皮下途徑免疫的小鼠血清抗體陽轉率分別為83.33%、40.00%和0.00%，抗體幾何平均效價(GMT)分別為1∶169、1∶32和0; 加強免疫后，肌肉、腹腔和皮下途徑免疫的小鼠血清抗體陽轉率均達100%，抗體GMT分別為1∶813、1∶609和1∶32，肌肉和腹腔途徑免疫的小鼠血清抗體GMT平均增長4.8倍和19.0倍; 加強免疫7 d的抗體陽轉率達100%;明顯高于初次免疫28 d和21 d; BALB/c小鼠與ICR小鼠相比，前者的中和抗體效價和抗體陽轉率明顯高于后者, 而小鼠年齡對中和抗體效價和抗體陽轉率的影響不顯著(P＞0.05); 免疫劑量對中和抗體效價和抗體陽轉率的影響顯著(P＜0.05), 高劑量病毒免疫小鼠后中和抗體效價和抗體陽轉率明顯比低劑量高(P＜0.05); 細胞因子檢測結果顯示加強免疫7 d后的白細胞介素10(IL-10)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的含量與初次免疫7 d的相比顯著增加。結論 BALB/c和ICR小鼠可做為CA16活病毒免疫原性評價的動物模型，以4～6周齡的BALB/c小鼠最為敏感。

柯薩奇病毒A組16型(CA16); 免疫原性; 細胞因子; 減毒活疫苗

柯薩奇病毒A組16型(Coxsackievirus group A tape 16, CA16)是引起手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD)的主要病原體之一，屬于小RNA病毒科(Picornaviridae); 腸道病毒屬(Enterovirus)。與另一種引起手足口病的病原體-人腸道病毒71型(Entrrovirus 71, EV71)相比，CA16引起的手足口病癥狀相對較輕，所導致的重癥比例和死亡比例也相對較低, 但該病毒亦有較強的傳播力[1]。近年來, 多個國家和地區相繼有CA16引起的HFMD報道，并且CA16感染也能導致重癥和死亡[2-5]。目前針對HFMD的另一主要病原體EV71的疫苗已批準上市。但是，單一的疫苗不能解決2種病毒共同傳播感染且均能誘發嚴重并發癥的問題，因此研發CA16疫苗尤為必要。評價疫苗的免疫原性是疫苗研發中的一個重點，目前一般采用嬰猴做為動物模型，但成本較高，所以迫切的需要建立完善的CA16免疫原性評價的小動物模型。

作者將本實驗室篩選出的CA16疫苗候選株病毒分別感染ICR、BALB/c小鼠, 測定中和抗體效價、細胞因子等指標, 分析品系、年齡、免疫途徑、免疫劑量以及免疫程序對中和抗體效價的影響, 為進一步的疫苗研發和評價提供一定的實驗數據基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級ICR、BALB/c小鼠(4周齡、6周齡、8周齡)由本所靈長類中心小動物實驗部提供[SCXK(滇)K2014-0002]，飼養于清潔級設施[SYXK (滇) 2010-007]。

1.2 試劑、病毒與細胞

細胞因子ELISA檢測試劑盒，由美國R&D Systems Inc.公司提供; CA16活病毒由昆明地區HFMD臨床疑似患者樣品分離而得(已鑒定)，由本科室保存。非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)、人胚肺二倍體細胞(KMB17細胞), 由本所質量檢定室提供。

1.3 實驗性疫苗制備

取傳代培養后生長狀態良好的致密單層KMB17細胞，棄細胞培養液，接種適量病毒液，置于37 ℃培養箱中吸附1.5 h后，加入細胞維持液，于37 ℃溫箱培養至細胞病變達75%以上時，收獲病毒，并且采用微量細胞病變法檢測病毒的感染性滴度為6.62 LgCCID50/mL，于-30 ℃凍存。

1.4 動物免疫

將CA16病毒收獲液做倍稀釋，稀釋后病毒感染性滴度為5.62 LgCCID50/mL。分別用病毒收獲液和病毒稀釋液通過腹腔、肌肉和皮下免疫小鼠(4周齡、6周齡和8周齡)，0.5 mL/只，5只/組，對照組注射等量的生理鹽水。初次免疫28 d進行加強免疫，劑量和途徑與初次免疫相同。采集初次免疫21 d、28 d和加強免疫7 d后的血清和血漿，于-80 ℃凍存。

1.5 血清中和抗體檢測(體外微量細胞病變中和法)

將血清于56 ℃水浴箱滅活30 min; 用稀釋液進行2倍系列稀釋, 加至96孔細胞培養板中, 50 μL/孔;將CA16活病毒稀釋到2 000 LgCCID50/mL，加至96孔細胞培養板中，50 μL/孔，于37 ℃中和90 min。將長成單層致密的Vero細胞消化，制備成細胞懸液(細胞濃度約為1×105個/mL)，在所有孔種加入準備好的細胞懸液, 100 μL/孔, 于37 ℃、5%CO2培養箱中靜置培養, 每日觀察并記錄細胞病變體積分數情況，第7日判定結果。以中和抗體效價≥1∶8判為陽性。

1.6 血漿細胞因子檢測

取小鼠初次免疫7 d與加強免疫7 d以及陰性對照的血漿采用小鼠細胞因子ELISA檢測試劑盒分別檢測各細胞因子水平。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 免疫途徑對中和抗體效價的影響

不同途徑免疫ICR小鼠, 檢測免疫血清的中和抗體效價, 初次免疫后28 d, 肌肉、腹腔和皮下途徑免疫獲得的血清中和抗體幾何平均效價(GMT)值分別為: 1∶169、1∶32、0。肌肉注射組明顯高于其他兩組(P＜0.05), 加強免疫后7 d，肌肉、腹腔和皮下三個免疫途徑的GMT值分別為1∶813、1∶609、1∶32。肌肉與腹腔免疫結果相近而且略高于皮下組(P＞0.05, 圖1)，肌肉免疫實驗組的中和抗體陽轉率在初次免疫28 d時高于皮下免疫和腹腔免疫實驗組的中和抗體陽轉率(表1)，而加強免疫后各免疫途徑組的陽轉率均達到100%。

圖1 不同免疫途徑的中和抗體效價

表1 免疫途徑與中和抗體陽轉率之間的關系

2.2 免疫時間對中和抗體效價的影響

在初次免疫28 d后進行加強免疫, 比較初次免疫21 d、28 d, 加強免疫7 d后3個時間點的血清中和抗體效價, 陰性對照組的小鼠血清在以上3個時間點都不能檢測出能中和CA16病毒的中和抗體，結果加強免疫7 d后的血清中和抗體效價明顯高于初次免疫21 d與28 d的抗體效價(P＜0.05, 圖2)，其中初次免疫28 d的血清中和抗體效價同樣比初次免疫21 d的高，這也能夠說明21 d的小鼠血清中和抗體效價未能達到最高水平，而隨著時間的延長抗體效價也相應增高; 并且BALB/c小鼠整體的中和抗體效價在初次免疫21 d、28 d以及加強免疫7 d后都要比ICR小鼠的效價高，說明BALB/c小鼠比ICR小鼠對CA16病毒敏感。采用卡方檢驗比較免疫時間對陽轉率的影響，結果顯示免疫時間對陽轉率的影響具有統計學意義(P＜0.05, 表2)。

圖2 中和抗體效價隨免疫時間變化趨勢

表2 CA16病毒免疫小鼠中和抗體陽轉率 %

2.3 不同免疫劑量對中和抗體效價的影響

用原倍病毒液(感染性滴度: 6.62 Lg CCID50/mL)與倍的病毒稀釋液(感染性滴度: 5.62 Lg CCID50/mL)免疫小鼠，分析血清中和抗體效價與免疫劑量之間的關系，原倍病毒液免疫的小鼠血清中和抗體效價明顯高于病毒稀釋液免疫的中和抗體效價(P＜0.05),并且原倍病毒液免疫的小鼠血清中和抗體陽轉率也高于倍病毒稀釋液的免疫的中和抗體陽轉率(表2),差異顯著(P＜0.05)，說明劑量的改變與中和抗體效價之間的量效關系。

2.4 小鼠品系及年齡對中和抗體效價的影響

比較兩種不同的小鼠ICR與BALB/c的中和抗體效價以及陽轉率，BALB/c小鼠明顯比ICR小鼠的中和抗體效價高(P＜0.05)，并且陽轉率也明顯較ICR小鼠的高(P＜0.05, 表2)，可以說明BALB/c小鼠與ICR小鼠相比較, 前者對CA16病毒要為敏感；比較不同年齡小鼠與中和抗體效價的關系，結果表明采用的4周齡、6周齡、8周齡的3個年齡的小鼠對中和抗體效價影響的差異不顯著(P＞0.05)。分析比較3個不同年齡小鼠免疫后血清中和抗體陽轉率，結果顯示差異不顯著(P＞0.05)，但是其中4周齡小鼠在初次免疫21 d和28 d的中和抗體陽轉率均高于其他兩個年齡的小鼠，而在加強免疫后3個年齡的小鼠中和抗體陽轉率均達100%。

2.5 小鼠血漿細胞因子檢測結果

檢測小鼠初次免疫7 d以及加強免疫7 d血漿白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-10、IL-13、γ-干擾素(IFN-γ)以及腫瘤壞死因子-α(TNF-α) 6個細胞因子的含量，比較小鼠各細胞因子含量的變化，結果加強免疫7 d的小鼠血漿IL-10、TNF-α含量均明顯高于初次免疫7 d的血漿中的含量，其中加強免疫7 d血漿的IL-10和TNF-α含量有明顯的增高(表3), 而初次免疫7 d血漿的IL-10和TNF-α的含量在檢測范圍下限無法檢出。同時檢測初次免疫和加強免疫7 d的陰性血漿的細胞因子含量，其含量在檢測范圍下限, 這說明初次免疫7d和對照組的血漿IL-10和TNF-γ的含量很低。IL-1β、IL-6、IL-13以及IFN-γ在初次免疫7 d以及加強免疫7 d的含量均處于檢測下限，無法檢測出含量，說明CA16感染小鼠未能引起IL-1β、IL-6、IL-13以及IFN-γ含量的明顯改變。從細胞因子的檢測結果可以看出CA16病毒感染小鼠后IL-10和TNF-α的含量均有顯著的增加，說明IL-10與TNF-α可以做為CA16感染小鼠后細胞免疫的一個陽性指標。

表3 小鼠血漿細胞因子含量檢測結果 pg/mL

3 討論

HFMD是以發熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要特征，由多種腸道病毒引起的傳染性疾病[6]。EV71和CA16感染交替出現，成為手足口病的主要病原體[7]。EV71疫苗臨床研究取得了突破性的進展[8]，這使疫苗的上市得以實現，而疫苗的突破性研究進展在于相關的動物模型的發展與應用，其中包括小動物模型[9, 10]與非人靈長類動物模型[11, 12]。然而與CA16相關的動物模型卻少有研究，其中多數為病毒感染機制和毒力評價模型的研究與應用[13]，而用于免疫原性評價的小動物模型未見報道。

本實驗采用ICR和BALB/c兩種小鼠，選用不同年齡段(4周齡、6周齡、8周齡)，設置不同免疫途徑、免疫劑量、免疫時間等多個條件，比較不同實驗條件對小鼠血清中和抗體效價以及抗體陽轉率的影響，通過檢測小鼠血漿中的細胞因子變化，從體液免疫和細胞免疫兩個角度對小鼠在CA16活病毒感染后的免疫原性進行評價。

不同免疫途徑對小鼠中和抗體效價和抗體陽轉率都有明顯的影響，其中通過肌肉免疫能有效的激起小鼠體液免疫產生較高的中和抗體，這可能與CA16能在肌肉組織中較好的繁殖有關。兩個不同劑量的病毒免疫小鼠，結果顯示劑量對小鼠血清中和抗體效價有明顯的影響，高劑量的病毒免疫能夠更好激起小鼠的體液免疫產生更高的中和抗體效價，而低劑量病毒的免疫原性明顯低于高劑量，說明免疫劑量與中和抗體效價之間的量效關系。免疫時間也是影響中和抗體效價的一個明顯因素，機體的免疫應答在初次免疫時應答往往較弱，但是當同種抗原再次免疫，其免疫應答明顯增加，抗體產生增多并且保留時間也較長，初次免疫21 d與28 d有少量的免疫應答，而在加強免疫后抗體效價明顯增高，符合免疫應答機制。實驗采用4周齡、6周齡和8周齡的ICR小鼠和BALB/c小鼠， 比較分析不同種屬和不同年齡對中和抗體效價和抗體陽轉率的影響，顯示病毒原液免疫組28 d，BALB/c小鼠抗體陽轉率在3個年齡段均達100%，而ICR小鼠抗體陽轉率最高的是4周齡達80%。加強免疫后，I C R小鼠各年齡段的抗體陽轉率也均達100%，說明加強免疫之前BALB/c小鼠對CA16病毒的感染其免疫應答比ICR小鼠強，在加強免疫后，這種差異就被免疫劑量彌補。但是在病毒稀釋液免疫組28 d和加強免疫后7 d, 顯示BALB/c小鼠的免疫應答確實高于ICR小鼠。分析小鼠年齡對中和抗體效價和抗體陽轉率的影響，表明年齡對中和抗體效價以及抗體陽轉率的影響不明顯，但4周齡小鼠相比6周齡和8周齡小鼠，中和抗體效價以及陽轉率都要高，這樣的結果在兩個品系小鼠中都成立。之前有報道[14]CA16病毒感染乳鼠，發病乳鼠癥狀表現為精神萎靡、 活動量減少、 前肢或后肢麻痹， 部分乳鼠前后肢均產生麻痹， 癥狀加重直至死亡，這說明CA16病毒感染小鼠，隨著年齡增長其感染率降低，并且癥狀也有減輕，這似乎與CA16感染人類的情況類似，主要為嬰幼兒易感染，并出現相應的癥狀，癥狀加重時會導致死亡，而成人一般為隱性感染。

分析細胞因子含量變化，表明CA16感染小鼠后IL-10和TNF-α的含量明顯增高，其結果也許可作為CA16感染小鼠后的陽性指標。

綜上所述，ICR小鼠和BALB/c小鼠在感染CA16病毒以后都能明顯反映出免疫劑量、免疫時間和免疫途徑對中和抗體效價以及抗體陽轉率的顯著影響，具有一定的年齡差異。此外還能產生明顯的細胞免疫應答，可作為CA16活病毒免疫原性評價的動物模型，為進一步系統研究CA16疫苗提供實驗資料。

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Immunogenicity of Coxsackievirus Group A Type 16 Strains in Mice

MENG Hua-qing, YANG Ting, XIE Tian-hong, LI Hua, YUE Lei, SONG Xia, ZHANG Ye, XIE Zhong-ping
(Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Yunnan Research Center of Vaccine Engineering Technology on Severe Infections Diseases, Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research and Development on Severe Infections Disease, Kunming 650118, China)

Objective To evaluate immunogenicity of Coxsackievirus group A type 16 strains (CA16) in mice and provide experimental data for further research.MethodsThe female BALB/c and ICR mice ageing 4, 6, 8 weeks were inoculated subcutaneously, intraperitoneally and intramuscularly with two different doses of CA16 live virus. Blood were respectively taken at 7, 21, 28 and 35 days after inoculation and serum neutralizing antibody titer was analyzed by micro-neutralization test in vitro and six cytokines were determined by ELISA. ResultsSeroconversion rates of the mice inoculated intramuscularly, intraperitoneally and subcutaneously were 83.33%, 40.00% and 0.00% at 28 days after the first inoculation respectively, and antibody geometric mean titers (GMT) were 1∶169, 1∶32 and 0. Seroconversion rates of the mice inoculated intramuscularly, intraperitoneally and subcutaneously were 100% at 7 days after the boost, and GMT were 1∶813 (4.8-fold), 1∶609 (19-fold) and 1∶32; Seroconversion rate was 100%, which was significantly higher than that of 28 and 21 days at the first inoculation. Neutralizing antibody titersand seroconversion rates of the Balb/c were significantly higher than that of ICR, but effect of the age on the neutralizing antibody titers and seroconversion rates was not significant (P＞0.05). The dose has significantly effect on the neutralizing antibody titer and seroconversion rates (P＜0.05). In high dose group, the neutralizing antibody titer and seroconversion rates was significantly higher than low dose. interleukin(IL)-10 and tumor necrosis factor (TNF)-α have a significant increase at 7 days after the boost, compared to the 7 days after the first inoculation.ConclusionBALB/c and ICR mice can be used as animal models of CA16 live virus immunogenicity evaluation, and the most sensitive models was 4-6 week old BALB/c mice.

Coxsackievirus group A type 16 strains (CA16); Immunogenicity; Cytokine;

R373.2+3 Q95-33

A

1674-5817(2016)06-0409-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.06.001

2016-08-23

云南省重點新產品開發計劃(2015BC008)

孟華清(1991-), 女, 碩士, 研究方向: 病毒性疫苗研究。E-mail: 754759796@qq.com

謝忠平(1965-), 男, 主任技師。E-mail: xzp218@126.com

Attenuated live vaccine