人誘導性干細胞產業前研究

張冬卉 （湖北大學，生物資源綠色轉化湖北省協同創新中心，湖北 武漢 430062）

人誘導性干細胞產業前研究

張冬卉 （湖北大學，生物資源綠色轉化湖北省協同創新中心，湖北 武漢 430062）

人誘導性干細胞在進入產業化之前，最主要的產業前研究方向包括以下三點．①大規模樣本收集，研究特異致病突變造成的疾病表型差異，構建基因改造的人誘導性干細胞，利用分化細胞進行疾病模型研究．②高效率，功能性誘導分化獲得終末分化細胞，用于細胞替代性治療，例如：血細胞分化，胰島細胞分化．③和基因工程，組織工程和發酵工程相結合，實現人誘導性干細胞或分化細胞的大規模制備．本文將著重分析進入真正的產業化應用之前，人誘導性干細胞研究所面臨的機遇和挑戰．

人誘導性多能干細胞；產業化；細胞分化；疾病模型；生物反應器

0 引言

2007年，人成纖維細胞被重編程得到人誘導性干細胞．2012年，該技術的發明者——山中伸彌獲得諾貝爾生理學或醫學獎．重編程技術，即利用人終末分化細胞（例如血細胞，或者成纖維細胞等）在體外經過重編程因子的處理，使之成為具有向人體各個終末細胞譜系分化潛能的“人誘導性多能干細胞”．經過體外生長因子或小分子的誘導分化，人誘導性干細胞能夠分化成為其他各類型終末分化細胞．人誘導性多能干細胞的出現，為個性化定制的細胞治療奠定了理論及實驗基礎．而人誘導性干細胞相關技術如何能夠真正造福人類，最重要的仍然是實現從“實驗室”向“生產線”的轉化．本文將就人誘導性干細胞研究向產業化應用轉變過程中可能遇到的重要問題進行分析．

1 大規模構建特異突變來源的人誘導性干細胞株，建立體外疾病模型

構建特異突變來源的人誘導性干細胞株是人誘導性干細胞從實驗室研究向產業化過渡的基礎．在研究突變?表型相互關系的過程中，可以解決如下問題．①進一步深化人誘導性干細胞向功能性細胞的分化，只有得到具有完整，成熟功能的終末細胞，才有可能比較突變型和正常型之間的表型差異；②和基因工程及組織工程相結合，從單細胞功能研究模式進化至組織模塊功能研究模式；③構建具有功能讀數的疾病模型，從而為藥物篩選提供精準的臨床前測試平臺．

在神經領域，人誘導性多能干細胞被誘導成為運動神經元，用來建立肌萎縮性側索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）模型［1］；分化成為多巴胺能神經元，用來建立帕金森病（Parkinson's disease，PD）模型［2］；分化成為運動神經元，建立脊髓性肌萎縮（spinal muscular atrophy，SMA）模型［3］；此外，亨廷頓病（Huntington's disease，HD）［4］，精神分裂癥（Schizo?phrenia，SCZD）［5］，自閉癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）［6］，Prader?Willi綜合征［6］，Angelman和Prader?Willi綜合征［7］，RETT綜合征［6］也已經被患者來源的含有突變的人誘導性多能細胞體外分化產生的分化細胞進行了體外疾病模擬．在心臟領域，LQT綜合癥［8－10］方面，已經能夠用患者來源的突變多能細胞株分化為心肌細胞，進行體外模擬．在血液及免疫領域，Fanconi貧血［11］，地中海貧血［12］，唐氏綜合征［4］，I型糖尿病［4］，粘多糖貯積病I型［4］，也已經能夠被體外模擬．并且，隨著技術的進步，疾病表型的模擬已經越來越多地從單細胞級別模擬轉變為組織模塊功能模擬，從單細胞類型疾病轉變為多細胞類型疾病模擬．例如：巴氏綜合癥［13］的疾病模擬，就是利用患者來源的突變多能干細胞分化得到心肌細胞，并在體外構建心肌組織模塊，在模擬疾病的基礎上利用基因編輯技術，對突變進行定點回復，取得了糾正疾病表型的效果，并在進一步尋找可能的治療藥物方面取得了積極的成果．

利用人誘導性干細胞體外分化構建疾病模型，一方面為研究疾病致病機理提供了規范、易操作、周期短的研究對象；另一方面，也為進一步探索藥物或基因治療的方案提供了體外直觀的評價體系．同時，對疾病進程的精確模擬，則為體外功能性細胞的誘導分化提出了更高要求．

2 人誘導性干細胞向功能性細胞的分化

早在人誘導性干細胞出現之前，胚胎干細胞向功能性細胞的定向誘導分化就已經經歷了多年研究．但是，由于胚胎干細胞獲得過程中存在的倫理學問題瓶頸，使得該研究始終停留在早期研究階段．隨著重編程技術的產生，利用皮膚及血液細胞便可以產生人誘導性多能干細胞，該過程并不需要破壞胚胎，這就避免了獲得人多能性干細胞過程中的倫理問題．隨之而來的，則是多能性干細胞向功能性細胞分化的飛躍性發展．

目前，被廣泛研究的細胞類型往往和人類重大疾病息息相關．如神經細胞，心肌細胞，胰島細胞，血管內皮細胞，視網膜細胞等．在致力于提高分化效率和目的細胞功能性的同時，化學合成小分子對傳統人工合成重組蛋白類生長因子在分化過程中的替代，進一步降低了細胞分化所需的成本．同時，各分化不同階段細胞表面分子標志的特異性鑒定，為分化過程中的質檢和目的細胞純化創造了基礎．

早在人重編程技術問世之前，麥迪遜大學的湯姆斯實驗室于2001年通過體外胚胎小體凝聚的方法，利用人胚胎干細胞分化成為人的血細胞［14］．流式細胞分析結果顯示，利用該方法分化得到的造血干細胞，經過進一步誘導，可以在體外分別得到人的巨噬細胞，紅細胞和血小板．隨后，在人重編程技術問世之后，血細胞的體外分化迅速地應用于人誘導性多能干細胞［15－16］，并在誘導分化過程中加以優化，得到高純度的終末階段血液細胞．血細胞分化的優勢在于血細胞在體內的原生狀態即為懸浮狀態，該分化體系較其他分化譜系有更強的轉化為大規模發酵罐式生產的潛力．由此可見，獲得功能性細胞，降低分化成本，創立質檢標準成為誘導性干細胞分化產業化首先需要解決的問題．

最新的研究［17］報道表明，人誘導性干細胞分化為功能型細胞并用于細胞治療已經進入臨床前期研究．其中，人誘導性干細胞分化為人視網膜色素上皮細胞，用于治療退行性黃斑病及分化為胰島素分泌細胞，用于治療糖尿病，已經進入二期臨床研究．與此同時，人誘導性干細胞分化為多巴胺能神經元，用于治療PD；分化成為少突膠質細胞，用于治療脊柱損傷；分化成為心肌細胞，用于治療心肌梗死等也已經進入了一期臨床研究．

臨床前研究的進行，一方面為人誘導性干細胞在臨床細胞治療的可行性方面提供了必不可少的依據，另一方面，也為人誘導性干細胞向功能性細胞分化的工業化生產提出了要求．和小動物實驗不同，可以應用于細胞治療的功能型細胞除了在純度上必須達到臨床治療的要求，在數量上也必須達到可移植或輸入的數量級．

3 發酵工程產生工業數量級的人誘導性干細胞產品

和實驗室研究不同，制備具有臨床實用性的干細胞產品，除了一般提到的安全性，功能性之外，還需要細胞數量突破實驗級別的壁壘．對于人誘導性干細胞而言，想要在細胞產品的數量上取得突破，向產業化轉型，早期的關鍵在于以下幾點．①從傳統的平板培養方式轉化為發酵罐式培養；②能夠在生產的不同時期，量化生產效率及質量標準；③分類提純并保證細胞產品儲存過程中的細胞活性．

相對于造血干細胞分離提純，人誘導性干細胞的全封閉發酵式培養還處于起步階段．人誘導性干細胞出現不久，早在2012年就有研究進行了懸浮式培養人誘導性多能干細胞生物反應器的設計［18］．和常用的微生物反應器不同，該反應器除了保證培養細胞的活性和物料平衡外，還需要維持人誘導性多能干細胞的功能．目前，已經有人誘導性多能干細胞50 mL～1 L的生物反應器投放市場．但是對于工業化生產來講，如何進一步地降低培養成本，將是人誘導性干細胞發酵工程下一階段面臨的重要問題．

和干細胞的維持性培養不同，分化階段的反應器設計將會面臨更多的實際問題．對于不同譜系的細胞，不同的分化階段，均需要細化和摸索新的反應條件．和平板培養方式不同，生物反應器條件下的誘導分化，不僅僅是簡單地從貼壁到懸浮，而是開啟了一個全新的分化方式，同時，還要面對逐級放大過程中，每一步嘗試的成本問題．目前，已經有研究建立了100 mL反應體系的從人誘導性干細胞向心肌細胞分化的生物反應器［19］，該反應器全程進行心肌細胞的懸浮分化，利用兩個小分子進行誘導分化，最終得到40萬細胞／mL的心肌細胞產率．這無疑是分化心肌在產業化生產上的重要一步．我們可以看到，高效率的心肌細胞體外分化條件是該設計能夠實現的基礎，同時，僅僅兩個小分子的誘導組合，區別于重組蛋白的誘導方式，有效地為反應器分化降低了成本．

細胞產品用于生產，則生產的過程必須進行質量控制，而質量控制的前提則是有穩定的作業體系和分步的鑒定標志．要符合國際醫藥品稽查協約組織（Pharmaceutical Inspection Convention and Pharmaceu?tical Inspection Co?operation Scheme，PIC／S）所制定的官方主管藥品優良制造規范（Good Manufacturing Practice，GMP）的標準．和以研究為基礎的干細胞產品制備不同，基于法規的干細胞產品的制備必須以GMP標準為指向，做到制備過程工藝可描述化、質檢標準可數字化、工程參數可控制化．基于這一點，多年來各個分化世系中，從早期的隨機分化，到后來的分步分化，每一步都有對應的檢測標志［20］．在檢測相關細胞標志的基礎上，優化分化體系，提高分化純度，已經成為誘導性干細胞分化的基本思路．但是，這都是建立在以平板分化為基礎的手工操作平臺上．想要讓干細胞分化產品從實驗室走向工廠，所要面對的是全新的問題和挑戰．這一方面，可以向蛋白質工程的蛋白產品制備進行借鑒．蛋白質工程同樣是利用細胞作為反應底物，但是相對于蛋白質工程，干細胞分化產品的目的產物則為功能性細胞，對生產過程要求更高．其要求具體體現為細胞狀態調整，生產過程中分化效率檢測及微調，終末目標細胞組份純化．雖然在實驗室研究中已有相關突破，但真正應用于大規模的生產制備，還需要在逐級放大系統中進行驗證和優化．

最后，功能細胞的保存和運輸也和干細胞產品的產業化息息相關，決定了干細胞產品是不是真正地能夠從生產線走向臨床和應用領域．而功能型細胞的保存及功能維持，一直是細胞產品生產中的重要一環．目前應用最為廣泛的無疑是臍帶血的凍存，相信隨著干細胞產業的興起，會有越來越多的研究能夠面向不同細胞類型，更好地解決這一問題．

4 結語

隨著越來越多的人誘導性干細胞基礎工作的進行，在漸漸完善實驗室相關的理論研究和使用安全性的討論之后，人誘導性干細胞的研究重點勢必將逐漸過渡到應用導向的相關研究．在這一過程中，所要面對的對象從原本的生物學問題轉變成為疾病人群，操作從原本的培養皿變成了反應器，這勢必要求我們本著更加嚴謹踏實的態度，立足全局，針對細節，將人誘導性干細胞從概念性展望，轉變成實實在在可以改善人類生活的細胞產品，從而服務于新一代的醫療體系．

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Study on human induced pluripotent stem cells before industrialization

ZHANG Dong?Hui Hubei Collaborative Innovation Center for Green Transformation of Bio?resources，Hubei Key Laboratory of Industrial Biotechnology，College of Life Sciences，Hubei University，Wuhan 430062，China

At present，the main industrial applications of human induced pluripotent stem cells（hIPSC） include the following three aspects：1）Large?scale banking of samples from different gene mutation lines．The study will focus on the genetic pathogen studied by in vitro disease modeling．2）high efficiency of obtai?ning functional differentiated cells for clinical purpose including cell therapy．3）Combination of genetic engineering，tissue engi?neering and fermentation engineering，to culture hIPSC or gener?ate differentiated cells in large?scale industrial bioreactor．This study will focus on the discussion of the opportunities and challen?ges of hIPSC in the industrialization before moving to the real in?dustrial application．

human induced pluripotent stem cells；industrializa?tion；cell differentiation；disease modeling；bioreactor

2095?6894（2017）06?69?03

R329．2

A

2016－11－05；接受日期：2016－11－22

張冬卉．博士，教授．研究方向：干細胞與組織工程．E?mail：15475726＠qq．com