噬菌體展示技術及其在病原微生物研究中的應用進展

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(南華大學病原生物學研究所，湖南 衡陽 421001)

·小專論·

噬菌體展示技術及其在病原微生物研究中的應用進展

鄧湘贏，曾焱華*

(南華大學病原生物學研究所，湖南 衡陽 421001)

噬菌體是能特異性地感染細菌的一類病毒，其基因數目少，結構相對簡單，容易在分子水平上操控其基因。噬菌體展示技術是將外源肽或蛋白以融合蛋白形式表達并呈現在噬菌體衣殼表面的分子生物學技術。與傳統的研究方法相比，噬菌體展示技術具有通量高、成本低、操作簡單、耗時短等優點。本綜述主要聚焦噬菌體展示技術在病原微生物抗原篩選、抗體制備和疫苗研制等方面的應用進展。

噬菌體； 噬菌體展示技術； 病原微生物

噬菌體是能特異性感染細菌的病毒，因其結構簡單、基因數目少而成為分子生物學研究的重要模型系統。Smith最早用絲狀噬菌體作為載體進行分子生物學研究并首次介紹了噬菌體展示技術[1]。噬菌體具有高度的基因靈活性是噬菌體展示技術的基礎。該技術可將外源蛋白的基因型和表型、蛋白質分子結合活性和噬菌體的可擴增性結合在一起。近年來，隨著分子生物學技術的不斷發展及各學科間的交叉融合，噬菌體展示技術被不斷地改進與完善，在蛋白質相互作用、細胞信號轉導、疾病診斷與治療、抗原表位篩選與疫苗研制等領域得到廣泛應用。本文主要介紹噬菌體展示技術的概況及其在病原微生物研究中的應用進展。

1 噬菌體展示技術概況

噬菌體展示技術是將外源多肽或蛋白表達并呈現在噬菌體表面的一種分子生物學技術，其原理是將外源DNA片段插入到一個編碼噬菌體衣殼蛋白的基因中，與衣殼蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面，由于展示的外源多肽或蛋白能保持良好的生物學活性，因而能與目標分子特異結合。同時，外源多肽或蛋白的融合表達并不會影響重組噬菌體感染宿主的能力，通過簡單的“生物淘選與擴增”即可獲得重組噬菌體。

目前，已經發現超過5 500種噬菌體，根據噬菌體的生活周期不同，可以將其分為烈性噬菌體和溫和噬菌體。常用的烈性噬菌體主要包括λ噬菌體、T7噬菌體和T4噬菌體等，溫和噬菌體主要包括M13和fd等。兩種類型的噬菌體作為載體時在以下幾方面各有優劣：①純化步驟：M13噬菌體在增殖期間不裂解宿主菌，噬菌體易于純化；而T7,T4和λ噬菌體等裂解性噬菌體，純化比較繁瑣。②生長速度：T7噬菌體比M13生長快，在幾個小時內就能形成噬菌斑。③穩定性：重組的T7噬菌體比M13更穩定，適應環境的能力更強。④插入片段大小：M13噬菌體允許插入的片段較短，而T7噬菌體可允許插入大于1 kb的外源基因。因此，研究人員應根據展示蛋白的性質和研究目的合理地選擇噬菌體載體。

2 噬菌體展示技術在病原微生物研究中的應用

2.1受體篩選多數病原微生物表面表達的某些特異的膜蛋白能與宿主細胞表面的受體結合，然而這些受體分子表達量很少，通常難以檢測到，更無法純化。利用噬菌體展示技術能高效篩選到這些膜蛋白的受體。目前有3種篩選方法：①用純化的病原微生物表面配體蛋白作為靶分子進行淘選；②用完整的病原微生物進行淘選；③將噬菌體肽庫注射到模型動物體內，噬菌體表面展示的潛在外源配體多肽或蛋白與特定組織結合，再解剖特定組織進行淘選。

如Basha等[2]以炭疽毒素主要受體為靶分子，從M13噬菌體展示肽庫中篩選到一段能與該受體特異結合的多肽，該多肽能有效地阻斷ANTXR1(Anthrax toxin receptor 1)和ANTXR2(Anthrax toxin receptor 2)與炭疽毒素的結合。乙肝病毒包膜蛋白上的preS1抗原對乙肝病毒黏附、感染肝細胞至關重要[3]。Ye等[4]通過淘選噬菌體多肽庫，得到了與preS1特異性結合的短肽B10，并證實該多肽能有效的阻止乙肝病毒黏附到肝細胞上。綜上所述，利用噬菌體展示技術可以篩選到病原微生物上的配體或者與配體相結合的、宿主細胞表面的受體，這對于病原微生物致病機制的研究至關重要，同時也為利用其模擬分子或拮抗分子阻擋病原微生物對宿主細胞的感染和疫苗研究奠定了理論基礎。

2.2抗原表位分析及抗原篩選噬菌體展示技術是低成本高效分析病原微生物抗原表位的研究方法，抗原表位的研究能為闡明病原微生物的致病機制、感染性疾病的診斷、免疫治療和疫苗研制奠定基礎。本課題組Zeng等[5]以純化的生殖支原體黏附蛋白(MgPa)的多克隆抗體為靶分子，從噬菌體展示隨機十二肽庫中篩選到MgPa的模擬表位。Cariccio等[6]用噬菌體展示技術篩選到了腦膜炎奈瑟氏菌表面粘附素A抗體的模擬表位。目前，噬菌體展示隨機肽庫是用于篩選病原體模擬表位的有力工具。

利用噬菌體展示cDNA文庫也能篩選到某些特異性抗原。Talwar等構建基于支氣管肺泡灌洗細胞和白細胞的T7噬菌體展示cDNA混合文庫，篩選該文庫獲得了1 152個肉狀瘤病的潛在抗原[7]。Kim等[8]證實利用噬菌體cDNA文庫篩選到的異質性核糖核蛋白H3(Hnrph3)為葡萄膜炎眼部的抗原之一。Guo等[9]利用噬菌展示技術篩選到類鼻疽伯克氏菌的保護性抗原。總之，噬菌體展示技術，尤其是噬菌體cDNA文庫為抗原篩選提供了便利。

2.3抗體制備單克隆抗體在醫學診斷與治療領域被認為具有劃時代意義，大部分單克隆抗體都可以從實驗室動物獲得，但是費時費力且產量低。通過噬菌體抗體庫技術可以快速高效的篩選到高特異性的單克隆抗體基因型，在原核系統中大規模表達后即可獲得相應的單克隆抗體。利用噬菌體展示技術獲取特異性抗體的主要優勢在于速度快、不需要免疫動物，成功避開了體內生產抗體的繁瑣步驟。Mohammadzadeh等[10]成功地構建了噬菌體抗體庫，從中篩選到了可以特異性中和HIV-1 p24的抗體。Chen等[11]從噬菌體抗體庫中篩選到4種能中和腸道病毒71型的抗體。Qiao等[12]用HIV-1糖蛋白gp120淘選噬菌體肽庫，獲得了一種新的人類單克隆抗體A16。

2.4早期診斷病原微生物表面的某些特異分子或抗原可用于微生物的特異診斷。在抗原未知或者不容易獲得的情況下，使用噬菌體展示肽庫技術可獲得相應的抗原表位，從而進一步找到可能的特異性診斷標志物，用于研發臨床診斷試劑。本課題組Wang等[13]以純化的結核病人血清為靶分子，從噬菌體展示隨機十二肽庫中篩選到能與結核病陽性血清特異結合的兩條多肽，基于這兩條多肽建立的結核病血清學診斷試驗具有較高的敏感性與特異性。Wu等[14]從噬菌體抗體文庫中篩選到能與流感病毒特異結合的單鏈可變區抗體，可用于流感病毒診斷試劑的研發。Jang等[15]從噬菌體文庫中篩選到能與肺炎鏈球菌表面蛋白A(Pneumococcal surface protein A,PspA)特異結合的多肽2B11，可用于肺炎鏈球菌感染的診斷。綜上所述，通過噬菌體展示肽庫獲得的抗體，具有很高的特異性和靈敏度，在臨床診斷上具有很好的應用前景。

2.5疫苗研制噬菌體作為疫苗載體，可以分為噬菌體DNA疫苗和噬菌體展示疫苗。與標準的DNA疫苗相比，噬菌體DNA疫苗由于有噬菌體衣殼蛋白的保護，能有效阻止DNA降解，從而能誘導更強、更持久的免疫應答。噬菌體展示疫苗能將外源性抗原展示到噬菌體表面，隨著噬菌體的增殖，外源性抗原的表達水平也不斷增加，使機體產生較高的免疫應答。

如本課題組Zeng等[16]將從噬菌體展示肽庫中篩選到的MgPa的模擬表位制備成多抗原肽，該多抗原肽能誘導小鼠產生較強的體液免疫與細胞免疫應答。Bahadir等[17]將HBcAg的全蛋白展示在M13噬菌體表面，證實該重組噬菌體在BALB/c小鼠體內有較好的免疫原性。Khurana等[18]利用噬菌體肽庫技術研制埃博拉病毒的疫苗。Li等[19]利用噬菌體展示技術淘選到針對于流感病毒血凝素亞單位2(HA2)的單鏈可變片段，可用于流感疫苗的研制。因此，噬菌體疫苗在病原微生物疫苗研究中顯示出巨大的潛力。

3 總結和展望

噬菌體展示技術以其高庫容、高效方便及靈活篩選等優勢在生命科學許多領域得到廣泛應用，尤其在病原微生物的診斷和治療領域正越來越受到重視。然而，噬菌體展示技術的應用也存在以下一些限制：①在載體的選擇方面，雖然噬菌體的種類有上千種，但最常用的載體只有屬于溫和噬菌體的M13，fd以及屬于烈性噬菌體的T7和T4等，這表明在噬菌體載體研究上還有很廣闊的空間。②噬菌體的增殖和相應外源肽或蛋白的表達要依靠宿主基因，因此，毒性的分子肽或蛋白不利于進行表達和展示，這為應用噬菌體展示技術研究毒性多肽或蛋白質帶來不便。③編碼多肽或蛋白質基因的偏愛性，可能導致噬菌體肽庫的多樣性受到限制。④攜帶有抗原模擬表位的噬菌體進入機體后，一方面誘導機體產生針對模擬表位的抗體，另一方面也誘導機體產生針對噬菌體和其它蛋白的抗體。⑤通過噬菌體抗體庫篩選到的病原微生物的特異抗體在產量、穩定性等方面還達不到臨床要求，仍需做大量深入的研究工作。噬菌體展示技術雖然存在以上缺陷，但隨著噬菌體展示技術和噬菌體肽庫技術的不斷完善與發展，該技術勢必會給病原微生物的診斷、治療與疫苗研制等帶來更廣闊的應用前景。

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10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.03.025

2017-01-04；

2016-03-24

國家自然科學基金(NO:31370207)資助.

*通訊作者，曾焱華，E-mail:zengyihua21cn@126.com.

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