環二鳥苷酸調控細菌生物膜形成的研究進展

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(1.南華大學醫學院病原生物學研究所，特殊病原體防控湖南省重點實驗室；湖南 衡陽 421001；2.湖南省分子靶標新藥研究協同創新中心)

·小專論·

環二鳥苷酸調控細菌生物膜形成的研究進展

胡繼宏1,2，朱翠明1,2*

(1.南華大學醫學院病原生物學研究所，特殊病原體防控湖南省重點實驗室；湖南 衡陽 421001；2.湖南省分子靶標新藥研究協同創新中心)

生物膜(BF)是細菌附著到接觸物表面形成的多細胞群體，生物膜的形成不僅有利于細菌的生存，同時也增強了感染性。環二鳥苷酸(C-di-GMP)是群體感應系統中的一種重要的胞內信號分子。包含GGDEF結構域的鳥苷酸環化酶(DGCs)可將兩分子的GTP合成C-di-GMP，并在含有EAL和HD-GYP結構域的磷酸二酯酶(PDEs)作用下水解。C-di-GMP的水平在這兩種酶調節下發生改變，通過影響下游受體調控細菌的毒性、運動性、纖維素合成、黏附性、生物膜形成等多種功能。本文就細菌生物膜形成和C-di-GMP的調節作用的研究進展做一綜述。

生物膜； 環二鳥苷酸； 細菌感染

細菌可以通過聚集或黏附到胞外多糖基質上形成生物膜在宿主中生存，生物膜細胞通常與游離細菌有不同的表型和生理特征。由于吞噬酶類、抗生素及抗體無法進入生物膜內部，因此生物膜的形成顯著增強了細菌對這些抗生素的抵抗能力,有利于其在宿主內生存而加劇宿主的損傷和慢性炎癥；同時生物膜釋放的游離菌又增加了細菌的感染性。生物膜的形成受多種因素的調節，其中C-di-GMP作為細菌中普遍存在的一種重要的信號分子，通過含量的變化參與了生物膜形成的調節過程。

1 細菌生物膜的形成和作用

生物膜(Biofilm，BF)的形成過程包括五個動態的階段：可逆的黏附、不可逆黏附、生物膜形成、成熟和消散。生物膜的形成開始于游離菌附著生長到生物或非生物表面形成的可逆性的黏附；之后細菌菌落分泌胞外多糖形成不可逆的黏附；接著菌落擴大聚集，結構更加復雜；逐漸成熟為三維的立體結構；最終生物膜結構中又釋放出游離菌到其它表面固著[1-2]。

生物膜是細菌包含在胞外多糖、蛋白質和DNA網絡中的復雜的三維群體，在宿主組織或植入物當中形成的生物膜與細菌的感染和抗生素抗性的增強有密切的關系[3]。Moskousitz等[4]以囊性纖維化病人中分離的銅綠假單胞菌為材料，發現生物膜形成后對β內酯酰胺類抗生素的抗性較游離細菌明顯增高。生物膜的形成增加了對抗生素的抗性，其中一個重要原因是生物膜的生長、蛋白質合成和新陳代謝活動是分層的，膜表面的細菌活動迅速，而中心的細菌生長緩慢甚至停止生長。相對于這一特性有些抗菌肽可通過穿透生物膜來起到抑制其內部細菌存活的作用[5]。

2 C-di-GMP的作用

2.1 C-di-GMP的合成和分解調控環二鳥苷酸(cyclic-di-GMP,C-di-GMP)在鳥苷酸環化酶(guanylate cyclase，DGCs)參與下由兩分子的GTP合成，同時又在磷酸二酯酶(phosphodiesterases，PDEs)的作用下水解。遺傳和生化研究表明，GGDEF結構域是DGCs的催化活性部位，EAL和HD-GYP結構域是PDEs的活性部位[6]。全基因組測序表明，包含GGDEF和EAL結構域的蛋白作為一種信號蛋白在細菌中普遍大量存在。Bharati等[7]人在分枝桿菌中發現，同時具有GGDEF和EAL活性的DcpA蛋白能夠調節胞內C-di-GMP的水平。

2.2 C-di-GMP的受體C-di-GMP與細胞表面的受體結合后，通過受體信號的轉導參與調控了細菌內的多種功能和進程，包括轉錄[8]、翻譯[9]、蛋白質活性[9]、蛋白質分泌和蛋白質穩定性[6]。最終通過影響胞外蛋白、胞外多糖的分泌來改變細菌的表型，從而調控生物膜的形成。C-di-GMP的一些不同特異性受體的分子結構和功能已經得到了充分的研究，這些受體包括PilZ結構域蛋白、退化的GGDEF和EAL結構域蛋白、轉錄因子等。

2.2.1 PilZ結構域蛋白 PilZ結構域蛋白是Amikam和Galperin在2006年用生物信息學方法發現的第一個胞內C-di-GMP受體，在生物發生上與GGDEF和EAL相近[10]。PilZ的功能包括調節生物毒性、細胞運動型和胞外多糖(如纖維素，藻酸鹽)的分泌等[11]。C-di-GMP如何結合不同的PilZ結構域蛋白并影響下游信號尚不清楚，但C-di-GMP與PilZ之間存在著很強的親和性，這與胞內C-di-GMP的含量低相吻合。

2.2.2 退化的GGDEF和EAL結構域蛋白 C-di-GMP與一些失去活性的退化的GGDEF和EAL結構域蛋白結合，改變了這些蛋白亞基間的交聯。如銅綠假單胞菌中的PelD蛋白[12]，以及霍亂弧菌中的CdgG蛋白[13]，都能與C-di-GMP結合，但對其功能和結構均無作用，所以這一分子特性可用于研制C-di-GMP的特異性抑制劑。熒光假單胞菌中包含退化的EAL結構域的LapD蛋白可以通過與C-di-GMP的結合，將C-di-GMP的胞內水平傳遞到胞外來控制生物膜的合成[14]。

2.2.3 轉錄因子 C-di-GMP還可與一些轉錄因子結合，調控基因的表達。例如銅綠假單胞菌中的FleQ蛋白作為C-di-GMP的受體，通過控制轉錄過程可以調節鞭毛基因的表達。與C-di-GMP結合后的FleQ蛋白失去與pel啟動子的聯系，導致pel操縱子啟動表達，而pel參與了胞外多糖的分泌[15]。

3 C-di-GMP與生物膜的形成

C-di-GMP作為一種細菌普遍存在的第二信使分子，通過DGCs，PDEs兩種酶對其量的調節，影響下游信號，從而調控細菌的多種生理活動。如在銅綠假單胞菌當中外界信號被跨膜受體蛋白接受傳導，轉錄調控因子AlgR與DGC mucR的基因啟動子結合增加了mucR的表達，從而提高胞內C-di-GMP的水平。

3.1 C-di-GMP促進胞外多糖的形成C-di-GMP可以調節胞外多糖的產生、細菌的定植和生物膜的形成等過程。胞外多糖分泌的增加和細菌的定植是生物膜形成的先決條件。在銅綠假單胞菌中，胞內高水平的C-di-GMP與PelD和Alg44蛋白的結合過程促進了多糖和藻酸鹽的合成，目前研究較為清楚的是合成酶依賴的合成途徑，在這種途徑中，多糖鏈的聚合是通過多亞基酶的催化來完成的。纖維素是細菌生物膜的重要組成部分，纖維素合成復合物中的糖基轉移酶可以通過與C-di-GMP結合被激活，促進了聚合物的延長，進而合成纖維素單鏈分子。胞內C-di-GMP量的增加最終導致胞外多糖的增多，從而促進了生物膜的形成和聚集。

3.2不同來源C-di-GMP對生物膜影響不同高水平的內源性C-di-GMP促進了細菌的運動，加強了鞭毛的形成和細菌的消散。Nakhamchik等[16]用質粒過表達C-di-GMP的方法在創傷弧菌中發現了這樣的調節過程。此外，外源性的C-di-GMP能抑制細菌生物膜的形成，Yan等[17]發現，在變形鏈球菌中，外源性的C-di-GMP有明顯的抑制細菌黏附的作用，并且一定濃度的外源C-di-GMP能顯著降低生物膜的形成，而且抑制呈劑量依賴性關系。總的來說，胞內C-di-GMP的增多能夠增強細菌生物膜的形成能力，而一定量的外源C-di-GMP卻能夠抑制細菌生物膜的形成。

4 結 語

自然界中絕大多數的細菌均能以生物膜的形式生存，它是細菌為了適應環境所形成的細胞聚集狀態。生物膜形成后的抗藥，引起慢性炎癥等特性為感染性疾病的治療帶來了巨大的困難，同時造成的反復感染也增加了病人的痛苦。近年來，對C-di-GMP的調節功能的研究不斷發展，對其參與的信號調節通路的研究也將更加完善。同時，C-di-GMP作為生物膜形成的調節分子，為生物膜研究提供了新的靶標，并為抗生物膜感染研究提供了方向。

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10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.03.026

2017-01-04；

2017-04-14

湖南省分子靶標新藥研究協同創新中心資助項目(湘教通[2015]351號).

*通訊作者，E-mail：nhzhucuiming@126.com.

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