無創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)應(yīng)用于地中海貧血的研究進(jìn)展

李浩賢，孫筱放

無創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)應(yīng)用于地中海貧血的研究進(jìn)展

李浩賢，孫筱放

地中海貧血是世界上最常見的單基因隱性遺傳病之一，主要分為α和β兩種類型，另外還有部分罕見稀有型。該類疾病在熱帶和亞熱帶地區(qū)的發(fā)病尤為顯著[1]，在我國廣東地區(qū)α和β地貧基因攜帶率均高達(dá) 10% 以上[2]。其發(fā)病機(jī)制為相關(guān)基因缺陷導(dǎo)致珠蛋白生成障礙引起相應(yīng)的貧血癥狀。α 地中海貧血主要是由于在 16 號染色體上 HBA1和 HBA2 基因不同長度的缺失或點(diǎn)突變，導(dǎo)致 Hb BART’s胎兒水腫綜合征和血紅蛋白 H 病（Hb H ?。τ?Hb BART’s 胎兒水腫綜合征的患兒在晚期妊娠或出生后數(shù)小時內(nèi)死亡[3]，而 Hb H 病的患兒出生后會出現(xiàn)較嚴(yán)重的貧血，需要給予及早的預(yù)防措施和支持治療[4]。β 地中海貧血主要是由于在 11 號染色體上 HBB 基因點(diǎn)突變而導(dǎo)致β 珠蛋白生成障礙，引起不同程度的小細(xì)胞低色素貧血，可分為重型、中間型和輕型。對出生后重型或出現(xiàn)癥狀的中間型 β 地中海貧血患兒的治療目前采用輸血作為首選，同時輔以鐵螯合劑[5]，而基因治療和造血干細(xì)胞移植等治愈方法則實(shí)現(xiàn)難度較大[1]。由于重型地中海貧血患兒的治療周期長、價格昂貴，因此加強(qiáng)對高風(fēng)險地中海貧血胎兒的預(yù)防顯得尤為重要。現(xiàn)階段對該類胎兒的主要產(chǎn)前診斷方法是超聲介導(dǎo)下的經(jīng)腹絨毛活檢術(shù)、羊膜腔穿刺術(shù)和臍靜脈穿刺術(shù)以取得胎兒的 DNA 進(jìn)行檢測[3]，但有創(chuàng)性檢查會造成流產(chǎn)、胎膜早破及宮內(nèi)感染等低風(fēng)險事件的出現(xiàn)[6]。

1 游離胎兒 DNA 的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用

1969 年，Walknowska 等[7]發(fā)現(xiàn)最早可在 14 周孕婦的血液中檢測到胎兒的淋巴細(xì)胞，這為無創(chuàng)產(chǎn)前診斷胎兒染色體異常提供了一個新方向。1997 年，Lo 的團(tuán)隊(duì)[8]在母親的血清和血漿樣本中發(fā)現(xiàn)了 SRY 基因，首次證實(shí)了游離胎兒DNA（cell-free fetal DNA，cffDNA）的存在，為無創(chuàng)產(chǎn)前診斷提供了可能。99% cffDNA 以小于 313 bp（在 193 ～313 bp 之間）的小片段存在于母親的循環(huán)血液中，而母源性游離 DNA 片段絕大部分大于 300 bp[9-10]。cffDNA 最早在妊娠 4～5 周時即可在孕婦外周血中檢測出來[11]，并且濃度會隨著孕期而增加[12]，其在孕婦血漿中的半衰期為16 min，產(chǎn)后 2 h 將會完全消失[13]。但是將 cffDNA 運(yùn)用到臨床檢測仍需克服以下缺點(diǎn)，如：①較低的富集效率[14]；②需要在高母源性 DNA 背景下檢測出低拷貝量的胎兒DNA；③當(dāng)母源性 DNA 分子突變型和胎兒的相同時，將難以鑒別[15]。

cffDNA 最先用于篩查 X 染色體連鎖疾病[16]和為Rh 陰性的孕婦提供產(chǎn)前診斷[17-19]，其準(zhǔn)確率均達(dá) 99% 以上[20]。此后，已有團(tuán)隊(duì)成功利用 cffDNA 對肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良[21]、原發(fā)性及張力障礙 I 型[22]、亨廷頓病[23-24]、軟骨發(fā)育不良[25]、先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥[26]及囊性纖維化[27-28]等疾病進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前診斷。2008 年，Chiu 等[29]首次將第二代測序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）成功運(yùn)用于非整倍的胎兒染色體異常無創(chuàng)產(chǎn)前檢測中。隨后該技術(shù)在胎兒染色體非整倍體無創(chuàng)產(chǎn)前診斷中得到廣泛應(yīng)用，其中對21-三體綜合征篩查具有高敏感性和特異性，此外對 Patau綜合征、Edwards 綜合征和性染色體異常的篩查具有一定的臨床意義[30-31]。

2 α 地中海貧血的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)

α 地中海貧血主要以東南亞缺失型（-SEA）最為常見，純合子的 SEA 缺失可以導(dǎo)致 Hb BART’s 胎兒水腫綜合征。Tungwiwat 等[32]和 Pornprasert 等[33-34]采用熒光定量方法對正常、α 中間型以及巴氏水腫患胎進(jìn)行區(qū)分，用特異性引物通過兩步即可達(dá)到檢測目的，具有方便、快速的優(yōu)勢，但仍需大量樣本進(jìn)行確認(rèn)。此外，Sirichotiyakul 等[35]對野生型和缺失型地貧基因設(shè)計(jì)引物，采用 Taqman 探針進(jìn)行熒光定量 PCR，通過計(jì)算 △Ct 得到有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的劃分值，進(jìn)一步劃分患胎的診斷值，這一方法能夠減少 79.2% 非患兒的侵入性檢測，但令人遺憾的是該方法對區(qū)分雜合子和正常胎兒基因型仍有缺陷。Ho 等[36]和 Yan 等[37]則是采用與缺失片段相關(guān)的具有信息性的父源性 SNP（single nucleotide polymorphisms）位點(diǎn)和 STR（short tandem repeats）位點(diǎn)對巴氏水腫綜合征進(jìn)行排除性診斷，可有效檢出巴氏水腫的患胎，但對 α 中間型的胎兒不具有診斷意義。Ge 等[38]選擇致病區(qū)域位點(diǎn)的基因拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNV）進(jìn)行分析，通過探針靶向捕獲 HBA 和HBB 上少于 1.5 Mb 的區(qū)域，運(yùn)用二代測序，通過相對拷貝值（relative copy ratio，RCR）將高風(fēng)險夫婦的母親的血漿樣本與正常樣本進(jìn)行對比，成功將攜帶純合東南亞型缺失的 α 地貧胎兒排除。總的來說，α 地中海貧血的診斷策略更傾向于采用排除性診斷，但基于 SNP 和 STR 的方法在臨床的應(yīng)用缺乏普適性，推廣較難；而運(yùn)用分析 CNV 的方法對樣本中胎兒 DNA 濃度的要求較高，其穩(wěn)定性也有待提高。

3 β 地中海貧血的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)

3.1 排除父源性突變遺傳的診斷技術(shù)

2002 年，Chiu 團(tuán)隊(duì)[39]對攜帶 CD41/42（-CTTT）突變的父親設(shè)計(jì)等位基因特異性引物和熒光探針，通過對熒光信號的檢測排除攜帶父源性突變位點(diǎn)的胎兒。Li 等[40]運(yùn)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）技術(shù)對高風(fēng)險夫婦的胎兒進(jìn)行父源性突變排除，檢測結(jié)果達(dá)到了 100% 敏感度和 92.1% 特異度。該系統(tǒng)精確度高，可檢測樣本量大，但花費(fèi)昂貴。該策略也存在局限性，其一，不能對患胎進(jìn)行地貧基因的分型；其二，僅能排除胎兒是否攜帶父源性突變；最后，需要侵入性檢查才能明確診斷。

臨床上很多情況下高風(fēng)險夫妻雙方攜帶相同的突變，因此許多方法不能達(dá)到排除性診斷的目的。與排除突變基因相比，新一代遺傳標(biāo)記 SNP 通過對 SNP 位點(diǎn)的連鎖分析，明確區(qū)分父母源性的等位基因，有效地達(dá)到排除性診斷的目的。隨著芯片技術(shù)的發(fā)展，Papasavva 等[41-42]運(yùn)用基于寡核苷酸芯片的陣列引物延伸（arrayed primer extension，APEX）方法，通過篩選 β 球蛋白相關(guān)的 SNP 位點(diǎn)，將 β 地中海貧血的無創(chuàng)診斷應(yīng)用于塞浦路斯人群。在我國，Chan 的團(tuán)隊(duì)[43-44]采用結(jié)合等位基因特異性陣列引物延伸（allele-specific arrayed primer extension，AS-APEX）方法開發(fā)了“Thalassemia”微陣列，對 20 個 β 地貧高風(fēng)險孕婦進(jìn)行篩查，患胎檢出率達(dá) 80%。Phylipsen 等[45]將焦磷酸解激活聚合反應(yīng)（pyrophosphorolysis-activated polymerization，PAP）與高分辨熔解曲線分析（high resolution melting，HRM）技術(shù)相結(jié)合，在大于 97% 的背景 DNA 中檢出小于 3%的目標(biāo) DNA，但該方法的應(yīng)用需要先證者或其他家庭成員才能確定父源性突變的連鎖 SNPs。2015 年，Xiong 等[46]通過長引物 PCR 對我國幾種常見 β 地貧突變位點(diǎn)進(jìn)行捕獲，再通過二代測序排除父源性突變，靈敏度達(dá) 100%。該方法的局限性在于，需要建立有效的連鎖 SNPs 位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫，部分家庭因缺失相應(yīng) SNP 位點(diǎn)而造成檢測成功率下降，導(dǎo)致在臨床上的應(yīng)用受到限制。

與此同時，科研人員也致力于采用不同的分子策略，力求在傳統(tǒng)檢測方法上得到更高的靈敏度，其中之一就是提高胎兒游離 DNA 的富集程度。Ramezanzadeh 等[47]通過對凝膠電泳后的小于 300 bp 的目的片段分別進(jìn)行手工提取和商業(yè)試劑盒提取 DNA，對父源性排除的診斷準(zhǔn)確率均達(dá)100%。該方法容易對樣品產(chǎn)生污染，對實(shí)驗(yàn)者操作要求較高。Galbiati 等[48]設(shè)計(jì)相應(yīng)突變位點(diǎn)的肽核酸（peptide nucleic acids，PNA）間接富集 cffDNA，達(dá)到封閉母源性DNA 模板的效果，結(jié)合芯片對地中海人群攜帶的常見7 種突變進(jìn)行檢測并成功診斷胎兒是否攜帶父源性的遺傳位點(diǎn)。但該技術(shù)需要對特異性突變位點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化，且不能用于夫妻攜帶同種突變的情況，這也限制了其常規(guī)大規(guī)模使用。隨后 Galbiati 的團(tuán)隊(duì)[49-50]運(yùn)用較低變性溫度復(fù)合擴(kuò)增PCR（co-amplification at lower denaturation temperature PCR，COLD-PCR）成功對多個常見 β 地中海貧血突變位點(diǎn)進(jìn)行父源性遺傳篩查。此方法通過在 PCR 過程中突變位點(diǎn)的變性溫度差異進(jìn)行富集，操作簡單，實(shí)驗(yàn)流程較快，雖然該技術(shù)需要對不同突變位點(diǎn)的變性溫度逐一摸索，但是能夠有效提升靈敏度。2015 年，Liu 等[51]將引物引入限制性內(nèi)切酶分析-聚合酶鏈反應(yīng)（primer-introduced restriction analysis-polymerase chain reaction，PIRA-PCR）法應(yīng)用于 β地貧的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷中，該團(tuán)隊(duì)運(yùn)用限制性消化酶選擇消化野生型等位基因，間接達(dá)到母親血漿中檢測父源性突變等位基因的目的，但酶切位點(diǎn)不一定適用于每一種突變類型，這極大限制了在臨床上的應(yīng)用與推廣。

3.2 母源性突變遺傳的診斷技術(shù)

對母源性遺傳位點(diǎn)的檢測有利于 β 地中海貧血的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷邁向臨床，令孕婦真正免于有創(chuàng)檢查。2010 年，Lo 等[52]通過對多個 SNP 位點(diǎn)進(jìn)行捕獲，然后篩選雜合性的 SNP 位點(diǎn)，運(yùn)用單倍型相對劑量（relative haplotype dosage，RHDO）分析結(jié)合序貫概率比試驗(yàn)（sequential probability ratio test，SPRT）構(gòu)建單倍型，成功對該家庭胎兒的基因型作出診斷。在該方法中篩選母親為雜合子（A/B）和父親為純合子（A/A）的 SNPs，通過靶向測序?qū)δ赣H血漿中的 SNPs 定位，對每個等位基因上相應(yīng)位點(diǎn)的讀長進(jìn)行計(jì)數(shù)。首先采用 SPRT 對單倍型 I（攜帶突變位點(diǎn)的等位基因）或單倍型 II（攜帶野生位點(diǎn)的等位基因）進(jìn)行觀察，然后計(jì)算每個篩選后的 SNPs 在同一單倍型的疊加，接著計(jì)算判斷胎兒的單倍型歸屬，最后對胎兒的基因型判斷。隨后，Lam 等[53]首先通過探針捕獲包含 HBB 基因簇的 288 kb 區(qū)域，通過 dPCR（digital PCR）的方法在無家系分析的情況下確定父親的單倍型，結(jié)合 RHDO 和 SPRT再確定母親的單倍型，該方法成功對兩個 β 地中海貧血家系胎兒的基因型進(jìn)行準(zhǔn)確判斷。前者方法存在的明顯局限性在于構(gòu)建父母單倍型時，需要利用外祖父母及祖父母或先證者的遺傳信息，采樣難度大，可行性低，適用人群少；而后者克服這一難點(diǎn)，但在實(shí)驗(yàn)中需定制針對疾病的芯片，令實(shí)驗(yàn)周期更長，成本更高。

2016 年，Hui 等[54]利用 10X Genomics 的 Linked Read 技術(shù)及 Illumina 的測序技術(shù)，對父母雙方單倍型分型，并成功應(yīng)用母親外周血分析胎兒是否遺傳 β 地中海貧血在內(nèi)的多種單基因病。該技術(shù)首先將大片段 DNA 與含有標(biāo)簽的凝膠珠子分布在同一個油滴中，每個油滴幾乎只有一個大片段 DNA，這樣每個油滴就形成一個小文庫，最后通過加熱令凝膠溶解，解除油滴封閉，混合產(chǎn)物在 Illumina測序平臺上測序。通過該方法可以得到跨度在 30～100 kb的 Linked Read 信息，再根據(jù)這些信息進(jìn)行單倍型分型。成功構(gòu)建單倍型后，分別采用 Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)和RHDO 分析推斷胎兒是否遺傳父親和（或）母親的致病位點(diǎn)。該方法的優(yōu)勢在于通過 Linked Read 的測序結(jié)果直接構(gòu)建單倍型，無需通過先證者提供額外的遺傳信息和復(fù)雜的計(jì)算，這不僅減少檢測費(fèi)用，而且擴(kuò)大了高風(fēng)險孕婦的適用范圍。此外，還避免采用獨(dú)特方法檢測特殊突變位點(diǎn)。但是仍然無法克服第二代測序的缺點(diǎn)，如：對高 GC 和高重復(fù)區(qū)域無法擴(kuò)增，導(dǎo)致不能提供足夠的 SNPs 位點(diǎn)構(gòu)建單倍型。

總的來說，建立父母及胎兒單倍型的檢測策略成為 β地貧無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的主要思路，該策略是基于 SNP 位點(diǎn)的分析建立，不同人群的有效位點(diǎn)位置不一、數(shù)量不同，仍需大量基礎(chǔ)研究篩選足夠多的有效 SNP 位點(diǎn)以及適用于不同家系的特異性 SNP 位點(diǎn)；cffDNA 含量較低而導(dǎo)致擴(kuò)增效率差，以及擴(kuò)增過程出現(xiàn)的偏差也是一個急需解決的問題；定制芯片的應(yīng)用雖然令捕獲程度更高，但使成本升高、實(shí)驗(yàn)周期增加。

4 未來技術(shù)展望

由于設(shè)備昂貴、操作繁瑣、捕獲效率低、擴(kuò)增效率低及擴(kuò)增偏差等問題，地中海貧血的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷目前仍處于研發(fā)階段。2015 年，由 Lv 等[55]提出的“循環(huán)單分子擴(kuò)增和重測序技術(shù)（circulating single molecule amplification and re-sequencing technology，cSMART）”有望解決這些難題，其將目標(biāo)區(qū)域 DNA 進(jìn)行標(biāo)記、環(huán)化、擴(kuò)增，再通過高通量測序，實(shí)現(xiàn)對突變等位基因的百分率進(jìn)行定性及絕對定量檢測，更準(zhǔn)確推斷胎兒基因型，該方法在肝豆?fàn)詈俗冃约蚁抵械靡则?yàn)證；2016 年，Song 等[56]運(yùn)用 cSMART 方法篩選有效 SNP 位點(diǎn)，成功對 Y 染色體上的 76-SNPs 進(jìn)行了檢測，基于該策略，在理論上可應(yīng)用于地中海貧血的無創(chuàng)診斷。近期出現(xiàn)以單分子實(shí)時測序和納米孔單分子測序?yàn)橹鞯牡谌鷾y序平臺，它們擁有高速度、高精度、免擴(kuò)增、高通量、長讀長等優(yōu)勢[57-58]。Guo 等[59]運(yùn)用單分子實(shí)時測序技術(shù)對目標(biāo)片段的連鎖 SNPs 進(jìn)行精確定位分析，這方法令單倍型的建立更加直接、簡便，不需利用高風(fēng)險夫婦家庭成員的遺傳信息，使計(jì)算方法簡化；2016 年，Shi 等[60]成功運(yùn)用長讀長測序組裝中國人基因組“HX1”，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。第三代測序平臺可以憑借其長讀長優(yōu)勢，獲取更多具有信息的 SNPs，可以準(zhǔn)確構(gòu)建父母基因組的單倍型，推斷胎兒基因型。相信在未來幾年內(nèi)，通過優(yōu)化原有技術(shù)或者應(yīng)用新的方法，必然使地中海貧血的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷應(yīng)用于臨床。

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廣州市科技和信息化局重點(diǎn)項(xiàng)目（201508020258、201400000003-4、201400000004-4）

510150 廣州，廣東省產(chǎn)科重大疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省普通高校生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科研究所

孫筱放，Email：xiaofangsun@gzhmu.edu.cn

2017-01-01

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.02.012