一種長期培養人神經干細胞的新方法

陳世明，章瑾，宣丹英，毛鐘鳴，陳鵬翾

一種長期培養人神經干細胞的新方法

陳世明，章瑾，宣丹英，毛鐘鳴，陳鵬翾

神經干細胞（neural stem cells，NSCs）具有自我更新能力和多向分化潛能。神經干細胞的移植對治療神經系統的損傷和神經退行性疾病都有直接或間接的作用[1-3]，臨床研究和應用對神經干細胞的需求日益迫切。但由于技術原因，神經干細胞在體外的培養存在易分化和易死亡的技術難題。目前，神經干細胞的獲取途徑主要是從多個胚胎或流產胎兒中分離并進行有限的培養擴增，但胚胎或胎兒源的貧乏及各胚胎或流產胎兒之間的差異性使得神經干細胞來源混雜，無法達到標準化，成為神經干細胞臨床化的重要限制因素。本實驗從流產胎兒中分離出神經干細胞，并在體外長期規?；囵B、擴增，為神經干細胞的研究提供穩定的、用之不竭的細胞來源，為臨床神經干細胞移植奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

DMEM/F12（1∶1）培養基購自美國 Hyclone 公司；重組人表皮細胞生長因子（rhEGF）、重組人堿性成纖維細胞生長因子（rhbFGF）、B27 添加劑、N2 Supplement、TP-EDTA均購自美國 Gibco 公司；肝素鈉和胰酶抑制劑購自美國Sigma 公司；慶大霉素購自上?，F代哈森（商丘）藥業有限公司；其他實驗材料有巢蛋白、多聚賴氨酸、維生素 E、腐胺、亞硒酸鈉、人轉鐵蛋白、黃體酮、L-谷氨酰胺、維生素 C 葡萄糖苷。

1.2 方法

1.2.1 培養基配制 取 1000 ml DMEM/F-2（1∶1）培養基，加入 5.9 g 4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）攪拌均勻，制成基礎培養液，使溶液 pH 值控制在 7.0～7.1，分別加入 200 μg 肝素鈉、30 μg 維生素 E、25 mg 重組人胰島素、1.6 mg 腐胺、6 μg 亞硒酸鈉、5.5 mg 人轉鐵蛋白、7 μg 黃體酮、300 mg L-谷氨酰胺、20 μg rhEGF、20 μg rhbFGF、50 mg 維生素 C 葡萄糖苷、40 000 IU 慶大霉素，混勻。

1.2.2 神經干細胞的分離 取孕 16周的人流胎兒腦組織，在無菌條件下分離出海馬組織，D-Hank’s液清洗，眼科剪剪成小組織塊，加入 0.25% 的 TP-EDTA 消化 10 min，胰酶抑制劑終止其消化。用 100 目不銹鋼細胞過濾篩過濾，去除大組織塊，離心收集沉淀細胞。將沉淀細胞重懸于神經干細胞培養基，制成單細胞懸液。

1.2.3 神經干細胞原代培養 經過細胞計數后以（1～2）×106/ml 接種到 T75 細胞培養瓶中。將細胞培養瓶置于5% CO2、37 ℃ 培養箱中進行培養。每天觀察細胞生長狀態，3～4 d 半量更換神經干細胞培養基一次。

1.2.4 神經干細胞傳代培養 神經干細胞在培養基中連續培養 20～30 d，神經干細胞球直徑為 500～1000 μm 時，把含有干細胞球的培養基用 200 ml 注射器吸出，經干細胞球切割器（不銹鋼篩網）切割，將每個大的神經干細胞球切割成 3～8 小塊（直徑 30～200 μm），將小塊干細胞球放入新的培養瓶中，并加入一半新配置的培養液，按 1∶2 或者 1∶4 比例分瓶傳代培養。按這種方法可以連續擴增培養人神經干細胞 2 年以上。

1.2.5 神經干細胞球的鑒定 取連續培養 30 個月的神經干細胞球懸液滴于經多聚賴氨酸包被的蓋玻片上，置 37 ℃培養箱中培養 24 h，使細胞黏附于載玻片上。室溫下 4% 多聚甲醛和 0.3% 戊二醛固定 15 min。DPBS 緩沖液漂洗3 次后，用含 5% 正常山羊血清的 DPBS（含 0.1% TritonX-100）在 37 ℃ 溫育 30 min 進行封閉。吸去封閉液，加抗人巢蛋白單克隆抗體，37 ℃ 溫育 3 h 后，用含 0.1% TritonX-100 的 DPBS 漂洗 3 次，各 10 min。加偶聯Rodamine 的第二抗體，37 ℃ 溫育 45 min。吸去第二抗體反應液，用 DPBS 漂洗 3 次，用封片液封片，熒光顯微鏡下觀察結果并記錄照相。

1.2.6 神經球細胞爬片的制備和分化鑒定 取培養 30 個月的神經干細胞球，直接吹打或用 0.25% TP-EDTA 溶液消化制成單細胞懸液。細胞計數后以 5×104/片密度種于經100 mg/ml 多聚賴氨酸包被的玻璃蓋玻片上，在 DMEM/F12培養基中添加 2% 胎牛血清，B27 添加劑（1∶50 稀釋），撤除生長因子（EGF、bFGF）進行分化培養。8 d 后進行免疫熒光細胞化學染色。熒光顯微鏡下觀察并記錄照相。

2 結果

2.1 原代活細胞形態學觀察

初分離的單細胞在倒置顯微鏡下觀察，大多為單個圓形亮球狀，沒有細胞突起，折光性好。培養 2～3 d 后，形成多個細胞組成的細胞團，形狀不規則，大小不一。10 d 以后，可見數十甚至上百個細胞組成的細胞球，形態成圓形或者橢圓形（圖 1A），且數量越來越多，體積越來越大。100 倍鏡下放大觀察，可見細胞團周邊細胞較亮，中間區域細胞密度高，透光性差（圖 1B）。

2.2 細胞切割傳代前后形態學觀察

連續培養 15～20 d 后，神經干細胞球為 500～1000 μm（圖 2），傳代時，本實驗采用自制的干細胞球切割器，將大的神經干細胞球切割成大小不一的 3～8 小塊（圖 2A1 ～A4）。將小塊干細胞球放入新的培養瓶中培養 5～7 d 后，小細胞團塊呈不規則形狀（圖 2B1～B4）。繼續培養至 15 d左右，細胞團塊逐漸增大，成為圓形或者橢圓形的神經球（圖 2C1～C4）。

圖1 倒置顯微鏡下觀察人神經干細胞球（A：×40；B：×100；C：×200；D：×400）

圖2 切割傳代后神經干細胞體外培養不同時期的形態變化[A1：切割后 1 d 細胞團塊（×40）；A2：切割后 1 d 細胞團塊（×100）；A3：切割后 1 d 細胞團塊（×200）；A4：切割后 1 d 細胞團塊（×400）；B1：切割后 7 d 細胞團塊（×40）；B2：切割后 7 d 細胞團塊（×100）；B3：切割后 7 d 細胞團塊（×200）；B4：切割后 7 d 細胞團塊（×400）；C1：切割后15 d 細胞團塊（×40）；C2：切割后 15 d 細胞團塊（×100）；C3：切割后 15 d 細胞團塊（×200）；C4：切割后 15 d 細胞團塊（×400）]

2.3 神經干細胞的免疫熒光染色鑒定

經 24 個月培養的神經干細胞黏附于蓋玻片上。經巢蛋白免疫熒光染色后，均呈陽性表達（圖 3）。

2.4 神經干細胞分化為神經元細胞的免疫熒光鑒定

誘導分化第 8 天進行 β 微管蛋白染色，結果呈陽性（圖 4）。

2.5 神經干細胞分化為星型膠質細胞的免疫熒光鑒定

培養 30 個月的人神經干細胞經誘導分化后第 8 天進行 GFAP 染色，結果呈陽性（圖 5）。

2.6 神經干細胞分化為少突膠質細胞的免疫熒光鑒定

培養 30 個月的人神經干細胞經誘導分化后第 8 天進行 O4 染色，結果均呈陽性（圖 6）。

圖3 神經干細胞巢蛋白免疫熒光染色[A：12 個月（×100）；B：24 個月（×100）；C：30 個月（×100）；D：30 個月（×400）]

圖4 誘導分化 8 d 后形成的神經元結構的免疫熒光染色鑒定（×400）

圖5 誘導分化 8 d 后形成的星型膠質細胞（箭頭所示）的免疫熒光染色鑒定（A：×100；B：×400）

圖6 誘導分化 8 d 后形成的少突膠質細胞（箭頭所示）的免疫熒光染色鑒定（A：×100；B：×400）

3 討論

神經干細胞的研究和應用是以成功的神經干細胞體外培養為基礎的，獲得高純度、高產量的神經干細胞是其臨床工程化的關鍵[4]。傳統的貼壁培養法[5]利用多聚賴氨酸等分子進行瓶底包被，使神經干細胞在瓶底進行擴增培養。但在培養過程中，因外界微環境的不穩定，貼壁的神經干細胞會趨向分化，無法長期穩定培養。傳統懸浮培養法[6]中，神經球在其增大過程中會導致營養物質、抑制分化因子和代謝廢物無法順利傳輸，導致中心神經細胞壞死或分化，故通過將大的神經球分離成小神經球以促使其繼續生長，達到擴增的目的。在分離大神經球時，傳統方法采用胰酶消化或機械吹打，易造成細胞損傷或分離不徹底[7]。本實驗中，采用自制干細胞球切割器分離細胞球，既能夠避免胰酶消化帶來的損傷，也能使分離的小細胞球大小更為一致，尤其對神經干細胞的臨床工程化具有重大作用。

與傳統培養基相比，本實驗培養基中添加了肝素、慶大霉素、維生素 E、維生素 C 葡萄糖苷、亞硒酸鈉和黃體酮等成分，在調節干細胞生長增殖和抑制其分化方面，發揮重要作用[8-9]。肝素能與許多生長因子結合形成穩定復合物，既可保持生長因子的活性，防止其因外界微環境的變化而失活或降解[10-11]，同時也可減緩生長因子的釋放，促進細胞增殖[12]。維生素 E 對神經元損傷有保護作用，除了通過抗氧化機制發揮作用外，還可以通過調節相關酶活性機制及調控相關基因表達發揮作用。維生素 C 葡萄糖苷是維生素 C的衍生物，不但能有效保護維生素 C 的活性，還擁有更好的溶解性、耐熱性和穩定性。維生素 C 和維生素 E 配合使用，能產生更好的抗氧化效果，更有效地保護細胞中的DNA、蛋白質、膜脂質不被自由基損傷[13]。胰島素能促進細胞攝取葡萄糖和氨基酸，從而促進細胞分裂、生長。腐胺能夠刺激和誘導神經干細胞生長和增殖。亞硒酸鈉能促進和參與神經干細胞代謝。人轉鐵蛋白可結合鐵離子，使神經干細胞合理利用鐵離子，并減少其對細胞的毒性，從而維持細胞正常狀態。黃體酮具有促進神經干細胞生長和調節作用。HEPES 可維持細胞液中酸堿平衡。本實驗中，通過對培養、傳代方法的改進和對培養基配方的調整，使人神經干細胞能夠在體外長期培養擴增，并保持增殖和分化能力。

巢蛋白是一種中間絲類型的蛋白，在神經干細胞早期階段，由神經上皮干細胞表達[14-15]，隨著神經前體細胞向神經元和膠質細胞分化而終止表達。本實驗中，對分離、培養后的細胞在體外進行巢蛋白免疫組織化學染色，其結果均為神經干細胞，且在體外分離、傳代培養后，仍具有增殖能力。神經干細胞具有分化為神經元細胞、星型膠質細胞、少突膠質細胞的能力[16]。β 微管蛋白是神經元細胞的結構蛋白，是神經干細胞分化過程中神經元的特有標志物。GFAP 是一種單獨存在的 III 型中間絲蛋白，在活化的星型膠質細胞中大量特異性表達。O4 是神經干細胞分化為少突膠質細胞過程中的一種特定標記物。本實驗中，人神經干細胞經分化后，特異性檢測均表達陽性，且分化后細胞形態與正常神經元細胞和星型膠質細胞無明顯差異。β 微管蛋白 III 陽性說明所鑒定的細胞已分化為神經元，GFAP 陽性說明所鑒定的細胞已分化為星型膠質細胞，O4 陽性說明所鑒定的細胞已分化為少突膠質細胞。該結果表明，神經干細胞具有分化為神經元細胞和星型膠質細胞的能力。在該研究中，神經干細胞的培養時間較其他研究更長，但分化能力并未減弱，從側面反應出該培養方法能夠良好地維持神經干細胞的穩定性。

神經干細胞的體外長期連續培養技術是神經干細胞研究及應用的重要基礎。神經干細胞培養法的優化，有利于獲得大量的標準一致的高質量神經干細胞，為進一步應用于神經系統的損傷修復和神經退行性疾病的治療打下基礎。

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310018 杭州，浙江奧瑞健生物技術有限公司

陳世明，Email：1279050771@qq.com

2016-12-30

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.02.017