基因編輯技術在CHO工程細胞株改造中的應用研究進展

蔡俊立，胡澤斌，沈毅珺

基因編輯技術在CHO工程細胞株改造中的應用研究進展

蔡俊立，胡澤斌，沈毅珺

基因編輯技術是近幾年迅速發展起來、可實現對基因組進行靶向精確修飾的一種生物技術，通過該技術可對基因進行定位突變、插入或敲除。從最初應用的鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFNs）到轉錄激活樣效應因子核酸酶（transcription activator-like effectors nucleases，TALENs），再到近兩年愈加火熱的 CRISPR/Cas9 系統，隨著新基因編輯工具的不斷發掘，對基因組進行定向改造的工作將變得更加高效精準、方便快捷[1]。

基因編輯工具可實現在基因組特定位點 DNA 雙鏈斷裂，隨后，斷裂的 DNA 雙鏈將主要通過兩種分子機制進行修復，機制 1：同源重組修復（HDR）即損傷的 DNA 使用同源 DNA 序列作為模板進行修復；機制 2：非同源末端連接修復機制（NHEJ）即非同源 DNA 片段斷裂末端彼此連接[2-3]。目前基因編輯工具主要應用于對特定基因的敲除（knock out）/敲入（knock in），而對基因敲低（knock-down）的研究甚少[1]。

在現代生物制藥產業中，哺乳動物細胞是最為常用的宿主細胞，尤其是中國倉鼠卵巢細胞（Chinese hamster ovary，CHO），常用于生產各種具有重要藥用價值、并具有復雜翻譯后修飾的蛋白，如治療性單克隆抗體等[4-5]。目前，CHO 已成為各大跨國制藥公司生產單克隆抗體藥物的首選宿主細胞。但在藥物研發過程中，如何得到高表達且產物質量穩定一致的工程細胞株是巨大挑戰之一。而使用新型基因編輯工具可方便快捷地改造甚至設計出理想的工程細胞株用于商業化生產。以下將概述目前三大主流基因編輯工具（重點介紹 CRISPR/Cas9 技術）在 CHO 工程細胞株改造方面的應用進展。

1 ZFNs 技術

鋅指核酸酶（ZFNs）是經過人工改造的核酸酶，它由鋅指蛋白（ZFP）和 FokI 核酸內切酶構成，其中鋅指蛋白來源于真核細胞轉錄子，可特異性識別基因組位點并與特定DNA 片段結合，而 FokI 是一種來源于 Flavobacterium okeanokoites 的核酸內切酶，負責在特定位點將 DNA 片段切割[6-7]。

1.1 快速篩選高表達 CHO 工程細胞株

ZFNs 技術已成功應用于 CHO 工程細胞株的定向改造。為了快速高效地篩選出高表達量細胞株，可通過 ZFNs技術敲除 CHO 細胞基因組內的谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）基因和二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）基因，Sigma Aldrich 公司已將這些經過改造的 CHO 細胞株（敲除 GS 或 DHFR）實現商業化[1]，且已有多家生物制藥公司將該細胞株用于生物制品（如單克隆抗體）的研發和生產。

1.2 改造 CHO 工程細胞株以抵御鼠源性病毒污染

在 CHO 細胞培養過程中病毒污染是一種致命性的災難，不僅給企業帶來巨大的商業損失，若被污染的生物制品流入市場還會對患者用藥安全性帶來極大風險，即使在整個細胞培養環節中均使用無動物源性成分或化學成分限定（chemically-defined）原材料來生產，也不能完全規避 CHO細胞感染動物源性病毒，如小鼠細小病毒（murine minute virus，MMV）污染的風險。Merck 公司旗下 MilliporeSigma的科學家最近利用 ZFNs 技術開發了一款可以抵御 MMV病毒的 CHO 細胞株。MMV 病毒侵染 CHO 細胞主要依賴于其病毒衣殼與 CHO 細胞表面的特定多糖（糖鏈末端含有唾液酸）相結合，而 CHO 細胞基因組內 SLC35A1 基因表達的蛋白負責將唾液酸轉運至高爾基體，并在高爾基體內完成該多糖鏈的組裝。Mascarenhas 等[8]使用 ZFNs 基因編輯技術靶向敲除 SLC35A1 基因，從而使 CHO 細胞可免受 MMV 病毒的侵染。研究結果顯示，當使用 MMV 病毒去侵染野生型和敲除 SLC35A1 基因后的 CHO 細胞時，野生型 CHO 細胞可迅速被侵染并造成細胞活力下降、增殖停止；而敲除 SLC35A1 基因后的 CHO 細胞卻未被MMV 病毒侵染，細胞生長保持正常。更令人興奮的是，當用該細胞系表達一種 IgG1 型抗體時，其表達能力和產物質量均未受 SLC35A1 基因敲除的影響。

2 TALENs 技術

轉錄激活樣效應因子核酸酶（TALENs）是繼 ZFNs 后出現的第二代基因編輯技術，TALENs 是一種存在于植物（水稻等作物）病原體黃單胞菌中的轉錄激活樣效應因子[9]，與 ZFNs 不同的是，TALENs 的 DNA 識別域識別特定單個核苷酸，因而可不受該核苷酸附近其他結構域的影響。在構建 TALENs 質粒時，需在靶位點編碼區選擇兩處相鄰的核苷酸序列來分別構建 DNA 識別模塊，最后將它們融合至 FokI 的 N 端[2]，與 ZFNs 技術相比，該技術具有以下幾方面優勢：①核酸酶設計成功率更高；②靶向專一性更高；③靶向效率更高。據統計，使用 TALENs 技術進行 NHEJ基因敲除，效率可達 30%～100%，該技術已成功應用于模式生物，如大鼠的基因敲除[10]、構建抗病水稻[9]以及人類干細胞的基因修飾[11]等，但目前該技術用于 CHO 工程細胞株改造的案例并不多。Sakuma 等[12]曾使用 TALENs 技術將一段單鏈 Fv-Fc 基因成功靶向插入到 CHO 細胞基因組內。

3 CRISPR/Cas9 技術

CRISPR/Cas9 最初發現于一種細菌獲得性免疫機制中，在該機制中 RNA 可引導 Cas 蛋白對入侵病毒或噬菌體 DNA 進行切割，使其無法在細菌內復制、擴增。后續研究發現該系統普遍存在于各細菌和古細菌中，目前來自Streptococcus p yogenes 的 CRISPR/Cas9 系統應用最為廣泛[13]。

3.1 CRISPR/Cas9 系統機制概述

CRISPR/Cas9 系統主要包括由不連續重復序列（repeat）和長度類似的間區序列（spacers）間斷排列而形成的 CRISPR 簇、前導序列（leader）和 Cas 蛋白組成，其中 Cas 一般位于 CRISPR 位點附近，它是一種 DNA 核酸內切酶，功能與 FokI 相似，在 gRNA 指引下可對特定基因片段進行精準靶向切割。對 CRISPR/Cas9 系統最主要的靶向要求是目的基因片段中要含有 PAM 序列，即 NGG。

使用 CRISPR/Cas9 技術進行目的基因敲除過程相當簡便，首先，要尋找 NGG 序列附近 20 多個堿基與tracrRNA 序列融合，設計出 sgRNA 并合成該序列，將該序列和 Cas9 基因連入同一載體，經歷轉化感受態、序列驗證、細胞轉染以及敲除效果檢測等過程，最終建立穩定敲除的細胞株。

目前 CRISPR/Cas9 技術已成功應用于細菌、酵母、哺乳動物細胞、植物和魚類等，以下將主要介紹使用該技術對CHO 工程細胞株的應用改造。

3.2 CRISPR/Cas9 技術用于加速 CHO 工程細胞株適應懸浮生長

使用懸浮生長的 CHO 細胞表達目的蛋白是當今生物制藥產業中的主流，而在無血清培養基中，貼壁生長的CHO 細胞需經過多次馴化才能完全適應懸浮生長，Lee等[14]通過 CRISPR/Cas9 對 CHO 細胞基因組的定向改造，極大縮短了 CHO 細胞適應懸浮生長的時間。具體方法如下，通過利用鏈特異性 RNA-seq 策略獲得了 CHO 細胞懸浮馴化過程中的轉錄組圖譜，系統分析發現，在 CHO 細胞逐步適應懸浮生長過程中，Igfbp4 和 Aqp1 基因下調最為明顯，使用 CRISPR/Cas9 技術靶向敲除 CHO-K1 細胞中這兩個基因后，可顯著加快該細胞適應懸浮培養進程，有助于進一步縮短生物藥研發周期。

3.3 CRISPR/Cas9 技術用于 CHO 工程細胞株異源表達

在生物制藥產業中，提高目的蛋白表達量也是現在面臨的一大挑戰。傳統轉染方法將目的基因插入到 CHO 細胞染色體組內的隨機位點，目的基因融合在宿主細胞染色體的位置不同，將直接影響克隆生長、表達及表達產物的質量，因而該方法需通過后續大量藥物加壓篩選、亞克隆等工作，最終才能得到表達量較高的單克隆工程細胞株，而使用CRISPR/Cas9 技術即可實現目的基因定點插入至 CHO 細胞染色體組內。Lee 等[15]通過 CRISPR/Cas9 技術并借助于設計好的供體質粒（含有目的基因以及進行靶向位點融合的一小段同源序列）將約 3.7 kb 目的片段插入到 CHO 基因組特定位點，并最終成功獲得穩定表達的細胞株。

雷帕霉素靶蛋白復合物 1（mammalian target of rapamycin complex-1，mTORC1）可根據周圍培養環境調節其生理代謝活動，研究表明增強 mTORC1 活力有助于提高細胞表達。McVey 等[16]使用 CRISPR/Cas9 技術靶向敲除CHO 細胞中抑制 mTORC1 活性的 TSC2 基因，敲除后的CHO 細胞株在補料批培養條件下 mTORC1 活力顯著提升。表型上，細胞直徑變大，單細胞表達量提高兩倍以上，且 TSC2 的敲除并未影響分泌抗體的質量。

CRISPR/Cas9 技術為提高 CHO 細胞目的蛋白表達、降低生產成本提供了又一新思路。未來隨著對 CHO 基因組更加深入的了解，可通過 CRISPR/Cas9 技術將目的基因定向融合至 CHO 基因組轉錄活躍區域，更加快速、高效地獲得高產量工程細胞株。

3.4 CRISPR/Cas9 技術用于 CHO 工程細胞株表達產物質量改造

CRISPR/Cas9 技術已開始用于單克隆抗體關鍵質量屬性的改造。抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用（antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC）是某些抗癌類單克隆抗體發揮藥效的重要作用機制，大量研究表明，抗體重鏈 N-糖鏈中缺少核心巖藻糖分子會顯著增強其ADCC 效應，進而極大提升藥效。Louie 等[17]通過CRISPR/Cas9 技術定向敲除 CHO 宿主細胞中 FUT8基因（編碼一種 α1,6 巖藻糖基轉移酶），成功獲得了表達無巖藻糖基化單克隆抗體的工程細胞株，且該基因的敲除未影響細胞表達量和產物其他關鍵質量屬性。Sun 等[18]也通過CRISPR/Cas9 技術對一種 anti-CD20 單克隆抗體進行去巖藻糖基化改造，同樣得到了非常理想的結果。

4 前景展望

基因編輯技術，尤其是 CRISPR/Cas9 將成為 CHO 細胞株工程改造最強有力的工具之一，但要實現該目標，在以下兩個方面仍需繼續進行探索。其一，目前 CRISPR/Cas9技術仍需不斷進行改進。在哺乳動物細胞中，由于細胞類型及靶位點的不同，使用 CRISPR/Cas9 技術進行基因改造時靶向效率有著很大差異（2.3%～79%），同時該技術還可能造成不同程度的脫靶突變，通過理性設計高活力 gRNAs 或改造 Cas9 蛋白可一定程度上解決上述問題。其二，需增加對哺乳動物細胞，尤其是 CHO 細胞全基因組、代謝通路的理解。目的基因插入 CHO 細胞基因組位點將直接影響細胞生長和表達，探究轉錄活性位點位置將有助于快速得到高表達工程細胞株；此外，表達產物關鍵質量屬性與多種關鍵代謝途徑有關，通過改造決定這些代謝通路的基因可最終獲得理想質量的目的蛋白[19]。

目前國內外使用 CHO 細胞生產的生物制品越來越多，質量源于設計（quality by design，QbD）的理念也逐漸深入人心，隨著基因編輯工具不斷改進以及新工具的出現，改造原有工程細胞株，甚至定制設計全新細胞株將變得更加高效快捷，在極大縮短生物制品開發周期的同時，還能生產出安全性更高、質優價廉的生物藥造福于全人類。

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201210 上海復旦張江生物醫藥股份有限公司（蔡俊立、沈毅珺）；100050 北京，中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑檢定所（胡澤斌）

沈毅珺，Email：yjshen@fd-zj.com；胡澤斌，Email：huzbcmba@163.com

2017-01-17

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.02.013