軟骨組織工程中支架材料研究的新進展

吳琪，亓建洪

軟骨組織工程中支架材料研究的新進展

吳琪，亓建洪

關節軟骨損傷是骨科較為常見的一種疾病。目前，骨軟骨缺損的處理方法主要有自體移植、微骨折術、軟骨下骨鉆孔術和自體軟骨細胞移植[1-2]，這些方法都有各自的局限性，均不能完全滿足臨床以及患者預后的運動要求。20 世紀90 年代，組織工程的概念第一次提出，這是一個綜合工程學與生命科學的跨學科領域，其目的是開發生物替代品，修復、維持與改善組織的功能，甚至重新打造整個器官。隨著時代的發展和科技的進步，組織工程技術發展迅速，并應用于軟骨的修復，為軟骨損傷患者的治療帶來了新的希望。成功的組織工程，一定離不開生物材料學科的發展。再生具有不同特性的生物組織，材料的選擇至關重要。在軟骨組織工程中，由生物材料構成的支架用以支持細胞的貼附和生長，對軟骨的修復起著載體的作用，影響種子細胞的生物學行為和培養效率，決定著移植后移植物能否與機體很好地融合、適應，能否較好地修復軟骨，因此軟骨組織工程支架在組織工程軟骨中起著至關重要的作用。近年來，支架的發展也很迅速，目前新的支架材料的開發主要側重于材料的生物學特性，新的材料不但要能作為支架，還要能與細胞相互作用，誘導細胞遷移、擴增、定向分化。制備支架的方法及微觀控制方面也在不斷地更新技術，最終目的都是用最接近天然生化特性和生物力學特性的組織來填補缺損，以期幫助患者恢復關節的部分乃至全部運動功能。本文總結近年來組織工程軟骨支架材料方面的文獻，對支架材料的最新研究進展作一綜述。

1 軟骨組織工程支架材料的性能要求

在軟骨以及大多數的天然組織中，細胞都被一種特殊的物質所包裹，這種物質就是具有 3D 形態的細胞外基質，這種 3D 形態由非常復雜的納米級網狀纖維構成，形成一種高度組織化的微環境，承載著細胞之間的通訊、氧氣與營養物質的轉運、廢物的排出和細胞的新陳代謝等功能，且這種環境是極化的，其內容物的運動方向也是一定的。軟骨組織工程原理和技術主要是將活細胞通過某種方式與支架載體合起來，在支架材料逐漸降解的同時，細胞在支架上增殖、分化并產生出新的組織和器官[3]。由此可見，支架在軟骨組織工程中起著非常重要的作用，對于支架的仿制，要求支架要盡量接近軟骨原本生存的微環境，具有更好的仿生性，主要應滿足以下幾個方面：①一定的空間結構：為種子細胞的生長提供支持的空間結構，引導構建出軟骨的基本輪廓。②適宜的生長環境：為細胞提供有益的生長環境，幫助細胞黏附，輔助細胞遷移，促進細胞增殖與分化。③組織相容性及降解率：軟骨組織工程支架材料的選擇必須考慮到軟骨修復的特殊要求，應當具有良好的生物相容性并具有與軟骨生長速度相匹配的降解速度。④機械性能：支架同時也應當具有一定的機械強度以維持相應的組織輪廓與體積。⑤孔隙率：能夠模擬軟骨細胞外基質的微環境，具有細胞之間的通訊、氧氣和營養物質的轉運、排出廢物和細胞新陳代謝等功能，滿足一定的孔隙率要求。Pan 等[4]對組織工程軟骨與軟骨下骨的最佳孔隙率進行了研究，指出組織工程軟骨與軟骨下骨支架材料的最佳孔隙率分別為 92% 與 77%。

由此可見，具有最佳效果的支架材料必然是仿生型材料。因此，在組織工程中需要引入這樣的 3D 支架，模擬軟骨細胞發育的微環境，將細胞有序地組織起來，以便達到預想的目的與效果。這些支架的功能是協助細胞的增殖與分化，幫助細胞順利向外擴散營養素與表達產物，向細胞與細胞內傳遞特定的力學和生物信息。Zorzi 等[5]將脂肪間充質干細胞接種到支架上，移植到羊的股骨內側股骨髁缺損上，結果顯示，接種了間充質干細胞的支架組修復效果及評分要優于單純支架組及空白對照組。

2 軟骨組織工程支架材料的分類

根據組織工程支架材料的來源，軟骨組織工程支架主要分為以下幾類：

2.1 天然聚合物

天然材料因其來源是天然的，相對來說有很多優點，比如生物相容性好、容易降解、毒性相對低、易吸收、不易產生炎癥反應等，但同時也有一定的不足，比如機械強度差、產品不易控制。天然材料主要包括藻酸鹽、瓊脂糖、膠原、明膠、纖維蛋白膠、天然脫細胞基質材料、臍帶沃頓膠等。

藻酸鹽是比較早用于支架制作的天然材料，藻酸鹽支架可以為種子細胞生長提供適宜的環境，特別是，交聯的藻酸鹽水凝膠通過包封水凝膠和多孔結構里的細胞來維持軟骨細胞及其球形細胞形態[6]。通過微環境模擬軟骨的胚胎發育促進軟骨形成和維持細胞表型。但是藻酸鹽不容易被哺乳類動物代謝降解，而且，其機械性能差和極易降解限制了其應用。膠原和明膠也可以維持軟骨的表型并產生基質，但機械性能差，在體內的作用不確定[7]。據報道，交聯可以使膠原分子內部和分子間通過共價鍵結合以提高膠原纖維的機械強度和抗降解穩定性。交聯方法包括物理交聯法和化學交聯法，其中以化學交聯法為主。化學交聯一般能達到較好的均一交聯效果[8]，常用的化學交聯劑包括碳化二亞胺、戊二醛、己異二氰酸酯、京尼平等，這些交聯劑在賴氨酸、羥賴氨酸、精氨酸等殘基之間通過單體或多聚物形式交聯。目前針對應用于軟骨組織工程的支架，也多采取化學交聯的方法，EDC類交聯劑可以在室溫條件下使膠原發生交聯，并且毒性較低，避免生物體出現嚴重的炎癥反應。

臍帶中的沃頓膠和軟骨基質具有相似的組成成分和生物學功能，并且免疫原性低，具有抑制免疫排斥、誘導宿主免疫耐受的能力。吳鴻[9]以臍帶沃頓膠制作新型生物軟骨支架并體外初步構建組織工程軟骨，結果顯示以此制作的支架具有與軟骨相似的組成成分、良好的微觀結構以及理化性能，細胞黏附率高，細胞毒性低，具備生物安全性和良好的生物相容性。呂涵寧等[10]采用第 2 代軟骨細胞與人臍帶沃頓膠取向支架復合培養，證實人臍帶沃頓膠取向支架具有良好的親和性和細胞相容性，有利于軟骨細胞黏附和增殖，細胞存活率高，是一種比較理想的軟骨組織工程支架材料。

2.2 人工合成材料

與天然生物材料相比，人工合成材料具有良好的生物相容性和力學強度，降解速率可控制，塑形效果較好，可以通過調整聚合物的比例、相對分子質量滿足不同的需求，但該類材料親水性差，對細胞親和力弱。常用于軟骨組織工程支架的人工合成材料主要是各類可生物降解的聚合物，如聚乳酸（PLA）、聚羥基乙酸（PGA）、聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）、聚己酸內酯（PCL）和聚 L-丙交酯-ε-己內酯（PLCL）等。

PLA 是一種人工合成的高分子材料，具有良好的力學性能，安全性高，且可被組織代謝吸收，代謝產物乳酸不會對人體產生毒性。經聚乙二醇（PEG）表面修飾的 PLA 具有更好的親水性和三維結構，降解速率明顯加快[11]。Izal等[12]將骨髓 MSC 種植于左旋聚乳酸（PLLA）支架上，結果顯示 PLLA 支架可有效吸附 MSC 并促進 MSC 向軟骨分化和細胞外基質（ECM）沉積。

PLGA 已經作為支架材料廣泛用于軟骨組織工程。Zhang 等[13]采用動態壓縮與外源性 SOX-9 結合對三維多孔 PLGA 支架上接種的脂肪間充質干細胞成軟骨能力進行評估，結果表明動態壓縮與外源 SOX-9 在 PLGA 支架上對脂肪干細胞誘導形成軟骨有促進作用，有利于關節軟骨再生。Kwak 等[14]將軟骨細胞接種到經富血小板血漿預處理的PLGA 網狀支架上修復裸鼠的半月板，熒光顯微鏡顯示在接種后 24 h 軟骨細胞在整個支架中附著均勻。電鏡結果顯示支架的空隙間相互貫通連接，修復半月板效果較好。Camarero-Espinosa 等[15]研究了多層聚合物納米復合支架，這種支架可以模仿軟骨的結構設計、化學信號和成熟的關節軟骨的機械特性，以空間控制的方式引導培養的軟骨細胞的形態、方向和表型，支持組織的生長，這種方法可以模擬天然軟骨，促進局部羥基磷灰石的形成，并與軟骨下骨整合。

2.3 混合支架

通過人工合成和天然聚合物的結合獲得有效的支架從而使軟骨再生，這方面也做了很多研究。經典的混合支架組織工程策略是基于隨機細胞接種和生長因子管理。該框架內細胞的分布和生物活性調控是不均勻和不可控的。這些缺點導致在組織構建中血供不足和細胞不能正確地融合，甚至細胞死亡。有一種新的生物制造方法，稱為“三維生物打印技術”，這種方法的引入可以克服上述缺點[16]。雖然這種技術是通過逐層打印的方式來構造物體，但是組織可以直接由細胞和細胞外基質蛋白以有序空間位置進行構建。多頭沉積系統和立體印刷已被用來排列各種組件，包括人工合成和天然聚合物、蛋白質、具有特定空間序列的細胞等。生物印刷技術促進了組織工程支架的發展，它模仿了天然關節軟骨的帶狀結構。Shim 等[17]最新研究報道稱三維細胞打印PCL-藻酸鹽支架是用多頭沉積系統包封軟骨細胞和生長因子。封裝在藻酸鹽水凝膠內的細胞的生存力不會被打印系統影響。植入 4 周后，在細胞打印的 PCL-藻酸鹽支架內軟骨顯示了更高的細胞外基質和糖胺多糖含量并且沒有任何免疫排斥反應。三維設計的混合型支架在動物模型中的應用發展仍需進一步探討。

近些年在支架的制備方面，特別是材料方面有了很多新的技術與趨勢。一些學者在研究中發現，結冷水凝膠、硫酸軟骨素、殼聚糖與透明質酸在軟骨組織工程中有良好的應用前景[18]。Alves da Silva 等[19]利用纖維粘合技術制出以殼聚糖為基礎的纖維網狀支架，應用于軟骨組織工程的支架制備。Tang 等[20]的研究證明，自體骨髓間充質干細胞來源的細胞外基質支架或可直接誘導軟骨細胞分化而無需外源性生長因子。Sheykhhasan 等[21]使用脂肪來源的間充質干細胞，在有轉化生長因子 β3 的條件下，比較了纖維蛋白膠支架、聚乳酸-羥基乙酸共聚物支架和藻朊酸鹽支架在相同環境下的差別，結果顯示纖維蛋白膠支架組中細胞分布均勻且增殖與軟骨方向分化最佳。Luo 等[22]將豬的關節軟骨進行脫細胞處理后制成組織工程支架，并與人軟骨祖細胞進行共培養，也取得了良好的效果。

3 軟骨組織工程支架制作新方法

對于支架來說，能夠重復組織本身的多層結構對于細胞的生長和組織的再生是很重要的。He 等[23]開發了熔融體3D 打印技術，制作了聚 ε-己內酯三維組織工程支架，復雜的曲面幾何形狀和微型纖維結構都可以呈現，并可以模仿原生組織的分層結構，為組織工程支架制備提供了一個新的方法。

天然的細胞外基質有一定的纖維屬性，這使得很多研究者把研究重點放在了以纖維為基礎的支架上，不同研究者應用的技術也不盡相同，有基于聚合物溶液的濕法、干-濕法與熔融紡絲法，纖維網狀結構的支架也可以通過種類繁多的針織方法來加工，也可運用壓力與溫度相結合的物理性工藝。Shao 等[24]采用綠色水溶劑同軸靜電紡絲法制備了一種由羥基磷灰石和柞蠶絲素蛋白組成的納米結構的復合支架，該材料具有良好的仿生和力學功能，是一種優良的具有生物相容性的骨組織工程支架。Zheng 等[25]采用動態-水流接收系統制備靜電紡絲取向型聚 L-乳酸-聚 ε-己內酯共聚物/I 型膠原納米纖維紗作為凍干 I 型膠原/透明質酸的軟骨相（海綿）骨架，這種支架同時含有結構和生物學標志，可以引導骨髓間充質干細胞向軟骨細胞分化。體外結果表明，納米紗 I 型膠原/透明質酸混合支架在促進取向、黏附力和骨髓干細胞的增殖方面比海綿支架更優。此外，經證實，接種在納米紗 I 型膠原/透明質酸混合支架上的骨髓基質細胞培養 21 d 后，II 型膠原蛋白表達和糖胺聚糖含量明顯增加。

Barron 等[26]使用激光微加工技術和熱卷邊技術創建了一個功能性梯度網絡支架，并通過兔模型來評估生物相容性，結果表明沒有炎癥或巨細胞產生。

細胞膜片的 3D 組裝也已經被成功應用于軟骨、血管、皮膚等組織，并已經有臨床產品用于患者。Itokazu 等[27]從人類骨髓間充質干細胞創建穩定的無骨架的軟骨樣細胞片，并評估其移植到裸鼠大鼠骨軟骨缺陷后的影響，結果顯示用此細胞膜片的軟骨修復情況比對照組好，且 12 周 Wakitani評分顯著改善。

微組織作為基本結構單元，也被成功用于組織的再生。Yin 等[28]對軟骨片進行濕法粉碎、過濾和脫細胞處理，成功制備了以軟骨細胞外基質源性微粒（CEDPs）為基礎復合軟骨細胞或 MSC 構建的微組織，修復大鼠、兔膝關節軟骨缺損，修復效果很好。這種微組織的方法用于軟骨修復為軟骨組織工程開辟了新的方向，并可能進一步廣泛應用于臨床手術。

4 軟骨組織工程支架的微觀結構控制

很多組織的基膜存在著大量會影響細胞行為（包括黏附、增殖、遷徙與分化）的納米級結構[29]，骨細胞外基質的成分比如膠原與磷酸鹽都富含納米結構，都有可能在細胞基質信號傳導中起作用。天然細胞外基質的納米結構具有很多特別的理化性質，這對于其包繞細胞的生物信號有著重要且微妙的影響。有研究人員制成了比以往更接近天然細胞外基質的納米結構支架，這種工程化納米材料至少在一個維度上小于 100 nm，可以在一定程度上模擬細胞外基質與修復受損組織[30]。為了能夠達到有效支持干細胞的目的，在過去的十年中不斷有納米纖維、納米管、納米顆粒制成的支架出現。這其中關于納米纖維的報道為最多，應用的材料從合成可降解的高分子聚合物如聚乳酸、聚乳酸-羥乙酸共聚物、聚乙烯醇、聚己酸內酯[31-32]，到天然材料如膠原、明膠與殼聚糖[33-35]；在骨移植手術中需要力學性能強大的材料，故有學者研究的納米管如碳納米管、二氧化鈦納米管也為組織工程支架提供了另外的選擇。Levingstone 等[36]對多層的軟骨支架進行了研究，證明了無論對于軟骨細胞進入支架后的橫向擴散與分層，還是對于軟骨下骨的修復及潮線的形成都比一般支架更好。

傳統方法制備軟骨支架有幾個關鍵條件無法精確控制：支架的尺寸，孔隙的形狀，孔隙之間的聯系以及分布。快速成型技術的進步使得支架的形態與最終形態可控程度大大提升，對于所產生孔隙相對于細胞偏大的問題，可以利用其與靜電紡絲和納米纖維技術的結合或依靠支架孔隙漸變技術來克服[37]，而 3D 測繪技術可以確保組織工程支架在力學上的穩定[38]。生物 3D 打印技術的發展也很快，可使用聚合物與水凝膠混合打印制成支架[39-40]。He 等[41]通過 3D微控水凝膠平臺成功地使鼠誘導多能干細胞衍生為軟骨，使自體組織工程軟骨移植物有可能實現，不需要依賴于有限的和侵入性的自體軟骨細胞采集。Jia 等[42]使用熱致相分離技術（thermal-induced phase separation，TIPS）制備了一種細胞外基質來源的定向支架，采用非定向支架作為對照組，與骨髓間充質干細胞復合修復兔關節軟骨缺損，在術后 24 周，雖然組織學和免疫組織化學分析與對照組沒有明顯不同，但是定向支架楊氏模量高出對照組 3 倍，生物力學特性更接近正常軟骨。

5 總結與展望

關節軟骨損傷是骨科常見的疾病，目前，常用的方法包括微骨折術、自體軟骨細胞移植等技術都有各自的局限性，組織工程技術的出現為關節損傷的治療帶來了新的希望。通過組織工程的方法來修復受損組織需要跨學科的綜合研究，要求結合仿生學、細胞生物學、材料學等不同領域的最前沿發展，隨著科學的發展，軟骨組織工程支架材料的研究與應用在體內實驗及體外實驗均已取得長足的進步，但離理想的軟骨支架材料還有很大的差距，目前應用的材料均存在著這樣或那樣的缺陷，比如形成的軟骨仍為纖維軟骨，而非透明軟骨；修復后的軟骨力學性能還不盡如人意；支架降解速度與軟骨的形成速度不十分一致。但隨著新材料的開發，制備技術的改良，會出現更符合人體關節軟骨天然結構及功能的支架材料，實驗成果將會更好地向臨床轉化，甚至于市場化，更好地服務人類，為軟骨損傷患者帶來新的希望。

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271000 泰安，泰山醫學院運動醫學研究所（吳琪），醫學與康復學院（亓建洪）

亓建洪，Email：jhqi7281@163.com

2016-11-21

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.02.016