大黃酸對3T3-L1前脂肪細胞增殖分化及相關基因表達的影響

李佳佳，梁耀月，董世芬，楊蓉芳，肖叢瑞，王晶

(北京中醫藥大學中藥學院,北京 100102)

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中 藥 研 究

大黃酸對3T3-L1前脂肪細胞增殖分化及相關基因表達的影響

李佳佳，梁耀月，董世芬，楊蓉芳，肖叢瑞，王晶*

(北京中醫藥大學中藥學院,北京 100102)

目的：研究大黃酸(1,8-dihydroxy-3-carboxyanthraquinone，Rhein，Rh)對3T3-L1前脂肪細胞增殖分化及相關基因表達的影響，從分子生物學角度探討大黃酸降脂的作用機理。方法：體外培養3T3-L1前脂肪細胞，采用噻唑藍法(MTT)研究大黃酸(5、10、20、40、80、160 μM)對3T3-L1前脂肪細胞增殖活性的影響；大黃酸(20、40、80 μM)干預3T3-L1脂肪細胞誘導分化，油紅O染色分析大黃酸對3T3-L1脂肪細胞分化過程中胞漿脂滴積累的影響；生化法檢測大黃酸對3T3-L1脂肪細胞中甘油三酯(Triglyceride，TG)的影響；實時熒光PCR法檢測過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma，PPARγ)、CCAAT增強子結合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein，C/EBPα)、脂肪酸合成酶(Fatty acid synthetase，FAS)mRNA的表達水平。結果：大黃酸160 μM對3T3-L1前脂肪的增殖有顯著的抑制作用，大黃酸20、40、80 μM劑量依賴地降低3T3-L1脂肪細胞中脂滴的積累，同時顯著降低3T3-L1脂肪細胞中TG含量，并且下調3T3細胞中脂肪分化相關基因PPARγ、C/EBPα、FAS mRNA的表達。結論：大黃酸能夠抑制3T3-L1脂肪細胞的誘導分化，降低細胞內TG含量，其作用機制可能與下調脂肪分化相關基因PPARγ、C/EBPα、FAS mRNA的表達有關。

大黃酸；3T3-L1前脂肪細胞；增殖分化；基因表達

肥胖是一種多因素引起的慢性代謝性疾病，是引發高脂血癥、動脈粥樣硬化、冠心病、糖尿病等肥胖相關疾病的重要因素。而肥胖是代謝綜合征的主要組成之一，亦是糖尿病、心血管疾病的獨立危險因子[1]。前體脂肪細胞的過度分化直接導致肥胖的發生、發展。因此，抑制前體脂肪的分化，研究脂肪組織中調控前脂肪細胞轉化為脂肪細胞的分子機制，對于預防肥胖的相關疾病有重要的意義。3T3-L1前脂肪細胞來源于小鼠胚胎成纖維細胞，具有單一的分化潛能[2]，體外經過誘導分化后可以分化為成熟的脂肪細胞。目前已成為國內外研究脂肪代謝最常用的細胞株之一。

大黃來源于蓼科植物掌葉大黃(RheumpalmatumL)、唐古特大黃(RheumtanguticumMaxim．ex Balf)或藥用大黃(RheumofficinaleBaill)的干燥根及根莖，性苦、寒，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經、利濕退黃之功效[3]。《神農本草經》謂大黃“主下瘀血、血閉、寒熱，破癥瘕積聚，留飲宿食，蕩滌腸胃，推陳致新”，其所治病證與高脂血癥“痰濁”“污血”“濁血”“瘀血”的病機相符[4]。現代研究表明，大黃具有減輕體質量，降低血脂等作用[5]。大黃酸是大黃主要有效成分之一，為蒽醌衍生物，具有降血糖[6]、抗病原微生物[7]、抗腫瘤[8]等藥理作用，并且大黃酸也是大黃提取物中唯一吸收入血檢測到的蒽醌類成分[9]。研究發現，大黃酸可以降低糖尿病肥胖大鼠脂肪組織抵抗素的表達，降低游離脂肪酸和血脂水平[10-11]；能夠降低高脂血癥小鼠肝臟脂肪含量，抑制脂肪在肝臟的沉積[12]。然而，目前其降脂的作用機制尚未完全清楚。本研究以3T3-L1前脂肪細胞為研究對象，探討大黃酸對3T3-L1前脂肪細胞增殖分化以及對脂肪分化相關基因表達的影響，以期為闡明大黃降脂的作用機制提供理論依據。

1 材料

1.1 細胞來源

3T3-L1前脂肪細胞株，購自北京協和細胞資源中心。

1.2 試劑與材料

大黃酸(北京華威銳科化工有限公司，批號16HC0210-2)；胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)(美國Corning公司，批號35076115)；DMEM高糖培養基(美國Corning公司，批號21115003)；新生牛血清(四季青生物工程公司，批號20151113)；牛胰島素(Insullin，美國Sigma公司，批號11070-73-8)；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-Isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)(美國Sigma公司，批號10163375)；地塞米松(美國Sigma公司，批號D1756)；噻唑藍(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-diphenytetrazoliumromid，MTT)(北京Biodee公司，批號298-93-1)；油紅O(北京Biodee公司，批號1320-06-5)；Triton-X100(北京Biodee公司，批號9002-93-1)；總蛋白定量測試盒(BCA法)(南京建成生物科技有限公司，批號20160704)；甘油三酯(TG)測試盒(南京建成生物科技有限公司，批號20160525)；Trizol試劑盒(美國Thermo公司，批號113705)；Revert Aid First Stand cDNA Synthesis Kit(美國Thermo公司，批號00285939)；SYBR Select Mast Mix: ABI(美國Thermo公司，批號1510506)；Fast Reaction Tubes: Applied Biosystems(美國Thermo公司，批號4323032)。

1.3 儀器

CO2恒溫培養箱(RCO-3000T-5V型，美國G.S.公司)；酶標儀(ThermoLabsystems Multiskan Mk3，美國Thermo公司)；倒置相差顯微鏡(DMILHC，德國Leica公司)；電泳儀(DYCP-31DN型，北京市六一儀器廠)；凝膠成像分析儀(Tannon 1600，上海天能科技有限公司)；Nano-200超微量核酸分析儀(杭州奧盛儀器有限公司)；StepOne Plus實時熒光定量PCR儀(ABI，美國)。

2 方法

2.1 細胞的培養

3T3-L1前脂肪細胞，用含10%新生牛血清的DMEM高糖培養液在5% CO2培養箱中培養，每2～3 d更換1次培養液，顯微鏡下觀察細胞的生長狀況，細胞融合度達到80%時，用0.25% EDTA胰酶消化種板。

2.2 MTT法檢測大黃酸對3T3-L1前脂肪細胞增殖活性的影響

選取對數生長期的3T3-L1前脂肪細胞，按1×104個/mL接種于96孔板，每孔加入細胞懸液200 μL，置于CO2培養箱中孵育24 h后，吸棄培養孔中的培養基，給藥組分別加入含一定濃度梯度的大黃酸(5、10、20、40、80、160 μM)培養基干預培養，每組設5個平行復孔，另設前脂肪細胞組(Preadipocyte)和DMSO溶劑對照組(DMSO)，分別培養24 h、48 h、72 h。至所需的時間后，棄去培養孔中的培養基，PBS洗1次。加入終濃度為1 mg/mL的MTT溶液，200 μL/孔，37℃培養箱孵育4 h后，細胞內形成藍紫色結晶。棄去MTT溶液，每孔加入150 μL的DMSO，輕微震蕩10min，使細胞內藍紫色結晶完全溶解后，于酶標儀490 nm波長處測定吸光度(A)。用GraphPad Prism 6計算公式，計算各時間點的IC50值。

細胞存活率(%)=A藥物組/A對照組×100%

2.3 3T3-L1脂肪細胞誘導分化

將3T3-L1前脂肪細接種到24孔或者6孔板中進行誘導分化。培養至接觸抑制后第2天，脂肪細胞組(Adipocyte)開始誘導分化，更換誘導液Ⅰ(含10%FBS，5 μg/mL胰島素，1 μmol/L地塞米松，0.5 mmol/L IBMX的DMEM高糖培基)，這一天記為誘導分化D0。D2，吸棄舊的培養基，更換誘導液I繼續培養。D3，吸棄舊的培養基，更換誘導液Ⅱ(含5 μg/mL胰島素的10% FBS的DMEM高糖培基)培養。D4，吸棄舊的培養基，更換誘導液Ⅲ(含10% FBS的DMEM高糖培養基)培養。這之后，每隔1 d，用誘導液Ⅲ換液，至D10收集細胞測定。

大黃酸分為20 μM組(Rh 20 μM)、40μM組(Rh 20 μM)、80 μM組(Rh 20 μM)和0.2% DMSO組(0.2% DMSO)，從誘導分化的D3開始給藥。D3藥物溶于誘導液II處理細胞，D4開始，藥物溶于誘導液III處理細胞，隔天換液，至D10天收集細胞測定。

另設前脂肪細胞組從誘導分化D0開始，用誘導液Ⅲ培養細胞，隔天換液。

2.4 油紅O染色

3T3-L1前脂肪細胞接種于24孔板中，第10 d后，吸棄培養液，PBS漂洗2次后用中性甲醛固定30 min。棄固定液，PBS漂洗后加入油紅O工作液，每孔400 μL，室溫染色1 h。吸棄油紅染液，用60%的異丙醇洗去浮色，PBS漂洗后在PBS液中鏡下觀察拍照。拍照結束，吸棄PBS液，加入4% NP-40(溶于異丙醇中)，溫和振蕩5 min，經油紅O染色的3T3-L1脂肪細胞可溶于4% NP-40溶液中，收集溶液，于540 nm處測定A值，即可定量測得油紅O染色脂滴含量。

細胞分化抑制率(%)=(A對照組-A藥物組)/A對照組×100%

2.5 TG含量測定

誘導分化完成后，細胞刮刀收集細胞，2% Triton X-100裂解細胞，超聲細胞破碎儀破碎細胞1 min，參照試劑盒說明書，檢測3T3-L1脂肪細胞中甘油三酯含量。BCA法測定蛋白濃度，以mmol/g prot校正細胞內TG含量。

2.6 實時熒光定量PCR檢測相關基因的表達

誘導分化完成后，用Trizol試劑提取各實驗組細胞中的總RNA，超微量核酸分析儀計算濃度，Revert Aid First Stand cDNA Synthesis Kit合成cDNA，SYBR Select Mast Mix: ABI配制10 μl反應體系，采用StepOne Plus實時熒光定量PCR檢測3T3-L1脂肪細胞相關基因的表達。PCR引物序列(見表1)。以β-actin為內參基因，分別計算各組2-ΔΔCT，表示脂肪細胞分化轉錄因子PPARγ、C/EBPα、FAS的mRNA的相對表達量。

表1 PCR引物序列及產物大小

2.7 統計學處理

數據用SAS 9.3軟件進行統計分析。多組之間的比較用單因素方差分析，方差不齊或兩組之間的比較用t檢驗。數據皆以(Means±SD)表示，P<0.05為有顯著性差異。

3 結果與分析

3.1 大黃酸對3T3-L1前脂肪細胞增殖的影響

由圖1可以看出，大黃酸對3T3-L1前脂肪增殖有抑制作用。隨著劑量的增大，抑制作用逐漸增強。給藥24 h、48 h、72 h后，大黃酸對3T3-L1前脂肪細胞的IC50值分別為187.70 μM、285.44 μM、230.95 μM。由此可見，大黃酸在20～80 μM之間對3T3-L1前脂肪細胞各個時間點的增殖無明顯影響，由此設大黃酸20、40、80 μM三個劑量組，考察大黃酸對3T3-L1脂肪細胞誘導分化的影響。

圖1 大黃酸對3T3-L1前脂肪細胞增殖活性的影響(Meams±SD，n=5)注：與Preadipocyte組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 大黃酸對3T3-L1脂肪細胞分化的影響

3T3-L1脂肪細胞分化成熟時，體積增大，細胞胞漿出現脂滴，經過油紅O染色，呈現“戎環”樣，是分化成熟的標志。如圖3所示，與對照組比，大黃酸40 μM、80 μM均可以減少脂滴的數目和體積；將脂滴溶解于NP-40中，測定OD值可以定量檢測脂滴積累情況，前脂肪細胞組細胞未分化，基本沒有脂滴出現，大黃酸20 μM、40 μM、80 μM三個劑量組分別不同程度地抑制3T3-L1脂肪細胞的分化。其中大黃酸40 μM、80 μM可顯著地抑制3T3-L1脂肪細胞的分化(P<0.05或P<0.01)，抑制率分別為16.47%、51.76%。(見圖2)。

圖2 大黃酸對3T3-L1脂肪細胞分化的影響(Meams±SD，n=4)注：與Adipocyte組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖3 油紅O染色示意圖(×200)注：A.對照組；B.Rh 40 μM；C.Rh 80 μM。

3.3 大黃酸對3T3-L1脂肪細胞TG的影響

從圖4可以看出，前脂肪細胞組3T3-L1前脂肪細胞中，TG含量極低。與對照組相比，大黃酸20 μM、40 μM、80 μM均顯著降低了3T3-L1脂肪細胞中TG含量(P<0.01，P<0.001)。

圖4 大黃酸對3T3-L1脂肪細胞TG的影響(Meams±SD，n=3)注：與Adipocyte組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3.4 大黃酸對3T3-L1脂肪細胞相關基因表達的影響

大黃酸作用于3T3-L1脂肪細胞后，與對照組相比，各劑量組均不同程度降低了PPARγ、C/EBPα mRNA的相對表達量。其中大黃酸80 μM顯著地降低了3T3-L1脂肪細胞中PPARγ、C/EBPα的表達量(P<0.001)。FAS是脂肪細胞內的主要酶，大黃酸給藥干預后，與對照組比，20 μM劑量組FAS相對表達量增高(P<0.05)，40 μM、80 μM兩個劑量組FAS的表達量顯著降低(P<0.01或P<0.001)見圖5。

圖5 大黃酸對3T3-L1脂肪細胞相關基因表達的影響(Meams±SD，n=3)注：與Adipocyte組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

4 討論

脂肪是生物體內能量貯存的主要形式，具有極其重要的生理功能，與機體的代謝密切相關，脂肪細胞分化異常可引起脂肪過多的積聚，從而導致肥胖、心血管疾病及糖尿病等的發生[13]。大黃酸干預3T3-L1脂肪細胞誘導分化結果顯示，大黃酸20 μM、40 μM、80 μM均可以顯著地抑制3T3-L1細胞的分化，減少胞漿中的脂滴的積聚；對3T3-L1脂肪細胞中TG含量定量檢測發現，大黃酸20 μM、40 μM、80 μM顯著地降低細胞中TG含量，隨著劑量增大，抑制作用增強，在降脂方面具有研究價值。

3T3-L1前脂肪細胞向脂肪細胞分化過程需經過細胞融合前增殖、融合/生長停滯、激素誘導/克隆擴增、永久性生長停滯/分化這四個階段，最終分化成為脂肪細胞[14]。3T3-L1脂肪細胞分化過程，受到多種激素、基因以及信號轉導通路的調控。眾多轉錄因子PPARs、C/EBPs、aP2、LPL等參與脂肪細胞分化過程。PPAR和C/EBPα在調控中起決定性的作用[15-16]。在誘導分化早期，C/EBPβ與C/EBPδ是最早表達的轉錄因子，能夠誘導PPARγ及C/EBPα的表達[17-18]，誘導分化的第2天，PPARγ、C/EBPα基因開始表達，3～5天后達到高峰[15,19]。PPARγ是棕色、白色脂肪細胞分化過程中必須的調控因子[20]，在胰島素抵抗、動脈粥樣硬化、脂質代謝與糖代謝、脂肪細胞分化和能量平衡方面起著重要的調節作用[21]，能夠調節C/EBP、脂代謝關鍵酶、以及轉運蛋白等的表達，進而影響脂肪細胞分化進程。C/EBPα是CCAAT增強子結合蛋白(C/EBPs)家族的重要成員，參與前脂肪細胞分化的調控[22]，只有PPARγ存在的條件下，C/EBPα才能誘導成脂化發生，而當不表達PPARγ時，C/EBPα不能促使脂化發生[23]，同時PPARγ能夠刺激前脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞，與脂肪形成密切相關。為進一步探討大黃酸抑制3T3-L1脂肪細胞分化的作用機制，在誘導分化的第3 d給予大黃酸干預，考察大黃酸對3T3-L1脂肪細胞早期標記因子PPARγ和C/EBPα mRNA表達的影響，實驗結果顯示，大黃酸80 μM能夠顯著下調脂肪誘導分化轉錄因子PPARγ和C/EBPα mRNA的表達，這可能是大黃酸抑制3T3-L1脂肪細胞誘導分化的機制之一。

FAS主要存在于肝臟、脂肪等組織中，在體內催化單酰輔酶A和丙二酰輔酶A結合成長鏈脂肪酸，是合成脂肪酸的關鍵酶[24]，與肥胖等疾病密切相關。研究表明，高脂飲食誘導肥胖大鼠脂肪組織FAS的mRNA水平升高，而肥胖抵抗的大鼠脂肪組織FAS的mRNA的表達顯著降低[25]。FAS出現在脂肪分化的中后期，當脂肪細胞分化時，脂滴增多，FAS表達增加[26]，FAS也是PPARγ下游涉及脂類存儲和調節脂代謝的靶基因[27-28]，受PPARγ的調控，增加脂肪細胞中脂滴的積聚，大黃酸40 μM、80 μM能夠顯著降低FAS mRNA的表達，表明大黃酸通過降低FAS mRNA的表達，從而抑制胞漿內脂質積累，減少了前脂肪細胞向脂肪細胞的轉化。

綜上所述，大黃酸能夠抑制3T3-L1脂肪細胞的誘導分化，降低細胞內TG含量，下調脂肪分化相關基因PPARγ、C/EBPα、FAS mRNA的表達，在降血脂、防治心血管疾病方面具有潛在價值。但體外實驗和體內實驗還是存在一定差異，因此進一步研究大黃酸對于脂質代謝的影響，探討其在體內作用機制具有重要的意義。

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Effect of Rhein on 3T3-L1 Preadipocyte Differentiation and Related Gene Expression

LI Jia-jia, LIANG Yao-yue, DONG Shi-fen, YANG Rong-fang, XIAO Cong-rui, WANG Jing*

(SchoolofChinesePharmacy,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China)

Objective:The effect of rhein (1,8-dihydroxy-3-carboxyanthraquinone，Rhein，Rh) on the proliferation and differentiation of 3T3-L1 adipocyte and the related gene mRNA expression was investigated. Method:MTT assay was used to detect 3T3-L1 cell proliferation by rhein (5,10,20,40,80,160 μM), rhein intervention 3T3-L1 adipocytes induced differentiation, oil red O staining and colorimetric analysis of the impact of rhein on 3T3-L1 adipocyte differentiation process of the accumulation of lipid droplets in the cytoplasm, biochemical detected rhein 3T3-L1 adipocytes triglyceride (TG). The expression of CCAAT enhancer binding proteins (C/EBPα), fatty acid synthetase (FAS), peroxisome proliferators activated receptor γ (PPARγ) genes was measured by real-time PCR. Results:The results showed that rhein(20,40,80 μM) could inhibit adipocyte differentiation and reduce intracellular TG content in a dose-dependent manner. Furthermore, rhein down-regulated the mRNA expression of C/EBPα, FAS, and PPARγ genes. Conclusion:Rhein can inhibit the differentiation of 3T3-L1 adipocytes,and the mechanism of action may be related to reducing adipose differentiation-related gene PPARγ,C/EBPα and FAS expression.

Rhein; 3T3-L1 preadipocytes; Proliferation and differentiation; Gene expression

國家自然科學基金資助項目(No.81503287，81430094)；教育部博士點基金項目(No.20130013120002)

李佳佳(1990-)，女，碩士，主要研究方向：中藥防治心腦血管疾病的研究。

王晶*(1973-)，女，副教授，碩士研究生導師，主要研究方向：中藥防治心腦血管疾病的研究。

2016-08-16

R285.5

A

1002-2406(2017)01-0001-05

修回日期：2016-09-10