蓬子菜有效成分對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷的保護(hù)作用

寧馨，董坤，孫超，馬英麗

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

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蓬子菜有效成分對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷的保護(hù)作用

寧馨，董坤，孫超，馬英麗*

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：研究蓬子菜中總黃酮和木犀草苷對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)炎癥損傷的保護(hù)作用。方法：以HUVEC為研究對(duì)象，用CCK-8檢測(cè)總黃酮及木犀草苷對(duì)HUVEC增殖的影響；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度LPS對(duì)HUVEC細(xì)胞周期的影響；酶聯(lián)免疫分析法檢測(cè)總黃酮及木犀草苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的HUVEC炎癥因子生成的影響；實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)HUVEC中P-選擇素E-選擇素 mRNA水平。Western blot法測(cè)NF-κB，P-IκB蛋白表達(dá)。結(jié)果：藥物濃度在6.25、12.5、25 μg/mL時(shí)細(xì)胞增殖率最大；總黃酮及木犀草苷能明顯下調(diào)LPS誘導(dǎo)的炎癥因子和黏附分子的分泌，同時(shí)也降低了P-選擇素E-選擇素的表達(dá)，NF-κB，P-IκB蛋白表達(dá)量。結(jié)論：LPS對(duì)HUVEC有抑制作用呈劑量、時(shí)間依賴性，給予總黃酮和木犀草苷后，損傷有明顯改善。

蓬子菜總黃酮；木犀草苷；炎癥；臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；脂多糖

蓬子菜(GaliumverumL.)為茜草科豬秧秧屬植物蓬子菜的地上部分。現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證明蓬子菜具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎和抗脂質(zhì)過(guò)氧化等作用；還可降低血液黏滯度,抑制血小板聚集,從而減少微循環(huán)疲滯的狀況，改善血液循環(huán)。其主要化學(xué)成份為黃酮、蒽醌、環(huán)西醚萜類及有機(jī)酸等[1]。呂勃川等應(yīng)用康脈II號(hào)對(duì)31例下肢深靜脈血栓患者治療并進(jìn)行臨床觀察,發(fā)現(xiàn)其可以有效治療下肢深靜脈血栓患者,臨床總有效率達(dá)93.54%[2]。康脈II號(hào)中就含有被廣泛使用的蓬子菜。

在1976年首先由著名學(xué)者Ross[3]提出，認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的病理變化過(guò)程，主要經(jīng)由炎癥反應(yīng)介導(dǎo)，并伴有氧化應(yīng)激的發(fā)生。目前得到廣泛認(rèn)可的發(fā)病機(jī)制是以脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)和損傷反應(yīng)學(xué)說(shuō)為基礎(chǔ)的炎癥理論[4]。有體內(nèi)研究表明，蓬子菜總黃酮不僅能夠降低血流阻力，改善血液循環(huán)，并且能夠改善血瘀證血液高凝黏的狀態(tài)，對(duì)心血管疾病導(dǎo)致的氧化損傷及炎癥反應(yīng)有很好的保護(hù)和治療作用[5]。蓬子菜在民間廣泛應(yīng)用，但關(guān)于蓬子菜有效成分體外抗炎作用的研究較少，本研究以蓬子菜為原料，進(jìn)一步深入蓬子菜中有效成分對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷保護(hù)作用的研究。

1 材料和方法

1.1 主要藥物與試劑

總黃酮及木犀草苷由蓬子菜干燥地上部分提取分離純化而成；RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液(PBS)(Hyclone公司)；青霉素、鏈霉素(碧云天公司)；二甲基亞砜(DMSO)、脂多糖(LPS)(Sigma公司)；CCK-8試劑(日本同仁公司)；PI雙染試劑盒(碧云天公司)；ICAM-1，VCAM，IL-6，IL-8 ELISA試劑盒(欣博盛公司)；TNF-α，IL-1β試劑盒(B&D公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Promega公司)；過(guò)硫酸胺(APS)、TEMED、瓊脂糖粉(美國(guó)Sigma公司)；PVDF膜(美國(guó)Millipore公司)；Trizol Reagent RNA抽提試劑(美國(guó)Invitrogen公司)。

1.2 儀器

CO2恒溫培養(yǎng)箱(Heal Force公司)；倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；Synergy2酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)；流式細(xì)胞儀(BD公司)；離心機(jī)(日本TOMY，MX-307)；低溫冰箱(英國(guó)Thermo公司)；熒光定量PCR儀(美國(guó)stratagene公司)；SDSPAGE微型凝膠電泳議(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3 細(xì)胞株

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)有限公司，使用胰蛋白酶-EDTA消化液傳代，在含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中置于培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)常規(guī)培養(yǎng)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 CCK-8法檢測(cè)總黃酮和木犀草苷對(duì)HUVECs增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞，以每孔2×104個(gè)/mL密度接種于96孔板，每孔加入200 μL,貼壁12 h，分別給予不同濃度總黃酮(3.125，6.25，12.5，25，50，100，200，400 μg/mL)和木犀草苷(3.125，6.25，12.5，25，50，100，200，400 μg/mL)，分別作用24 h，48 h，72 h。每孔加入20 μL CCK-8試劑，混勻，37℃培養(yǎng)1.5 h，使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀于490 nm測(cè)定OD值。

2.2 LPS誘導(dǎo)的炎癥模型的建立

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞，以每孔2×104個(gè)/mL密度接種于96孔板，每孔加入200 μL,貼壁12 h，分別給予不同濃度LPS(0，1，5，10，20，50，100，200 μg/mL)，每組三個(gè)復(fù)孔，經(jīng)過(guò)4 h，24 h，48 h的損傷，同上采用CCK-8法測(cè)OD值。

2.3 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)LPS對(duì)細(xì)胞周期的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞以每孔105個(gè)/mL密度接種于6孔板中，每孔加入2 mL，貼壁12 h。分空白對(duì)照組和模型組，模型組給于10 μg/mL LPS，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，離心棄上清，以4℃預(yù)冷的70%乙醇固定過(guò)夜后，PBS洗滌1次，加入碘化丙啶染色液1 mL，37℃避光孵育30 min，用流式細(xì)胞儀在發(fā)射波長(zhǎng)620 nm處檢測(cè)各組細(xì)胞紅色熒光。

2.4 酶聯(lián)免疫分析法檢測(cè)炎癥因子的表達(dá)水平

取對(duì)數(shù)期的HUVEC細(xì)胞，按104個(gè)/ml的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)12 h使細(xì)胞貼壁，實(shí)驗(yàn)分為八組(總黃酮高中低劑量組，木犀草苷高中低劑量組，模型組，空白對(duì)照組)，每組三個(gè)復(fù)孔，先給藥培養(yǎng)24 h后，除空白對(duì)照組外其他組給于10 μg/mL LPS，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取細(xì)胞上清液按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行炎癥因子的含量檢測(cè)。

2.5 PCR測(cè)P-選擇素，E-選擇素mRNA的表達(dá)

收集各組細(xì)胞，加入1 mL Trizol提取總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒講總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR擴(kuò)增，引物序列及PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1，PCR反應(yīng)條件為95℃，3 min變性；在進(jìn)行94℃，20 s，62℃，40 s循環(huán)擴(kuò)增，共40個(gè)循環(huán)。

2.6 Western blot法測(cè)NF-κB蛋白表達(dá)

收集各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，按照BCA蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)使用說(shuō)明操作,測(cè)定蛋白濃度。配制分離膠，上樣跑膠。將PVDF膜放入甲醇中浸泡使用，將海綿墊，濾紙，分離膠，PVDF膜按順序放好，然后插入轉(zhuǎn)膜電槽。用Blocking buffer封閉轉(zhuǎn)印膜。分別進(jìn)行一抗二抗孵育，最后顯色曝光，分析結(jié)果。

表1 引物序列及PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 總黃酮和木犀草苷對(duì)細(xì)胞增殖的影響

如表2、圖1，給藥組在6.25，12.5，25 μg/mL濃度的增殖率顯著高于空白組(P<0.01)，濃度為400 μg/mL的藥物明顯抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，72 h抑制作用明顯大于48 h大于24 h,因此選取6.25，12.5，25 μg/mL為低、中、高給藥劑量。

表2 CCK-8法檢測(cè)總黃酮和木犀草苷對(duì)細(xì)胞增殖

注:與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Figure.1 the data of the OD of the inflammation factors

3.2 LPS誘導(dǎo)的炎癥模型的建立

與對(duì)照組相比模型組的增殖率明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，隨濃度的增加，其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制程度也逐漸增強(qiáng)(P<0.01)抑制作用存在濃度依賴性。倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示：未經(jīng)LPS處理的對(duì)照組HUVEC 細(xì)胞擁簇成團(tuán)貼壁生長(zhǎng)，呈鵝卵石樣鑲嵌排列，細(xì)胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核清晰，細(xì)胞伸展性良好，邊界清晰。LPS處理后 HUVEC 細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞呈現(xiàn)不規(guī)則狀，細(xì)胞質(zhì)變得渾濁，細(xì)胞突起伸長(zhǎng)，細(xì)胞間距增寬。參考實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)最終選定炎癥損傷濃度為10 μg/mL LPS，損傷時(shí)間為24 h。見(jiàn)表3。

表3 CCK-8法檢測(cè)LPS對(duì)細(xì)胞增殖的影響

注:與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)LPS對(duì)細(xì)胞周期的影響

如圖2為空白組細(xì)胞周期情況，圖3為模型組細(xì)胞周期情況，與空白組相比，LPS 10 μg/mL組G1期比例明顯高于對(duì)照組，S期細(xì)胞與空白組比較明顯減少。LPS使HUVEC滯留在G1期。

Figure.2 the result of the control group

Figure.3 the result of the model group

G1(%)G2(%)S(%)空白組32.561.0866.36模型組46.012.9551.04

3.4 酶聯(lián)免疫分析法檢測(cè)炎癥因子的表達(dá)水平

結(jié)果見(jiàn)表5，模型組與空白對(duì)照組比較，細(xì)胞上清液中的IL-6，IL-8，ICAM-1，TNF-α都明顯增高(P<0.05，P<0.01)高劑量組的治療作用明顯優(yōu)于中、低劑量組，總黃酮組作用優(yōu)于木犀草苷組，說(shuō)明藥物對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥損傷有良好的保護(hù)作用。

表5 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子含量比較

注:與模型組比較，**P<0.01，*P<0.05;與空白組比較，△△P<0.01，△P<0.05。

3.5 PCR測(cè)P-選擇素，E-選擇素mRNA的表達(dá)

表4，5結(jié)果表明，空白對(duì)照組中HUVEC細(xì)胞的P-選擇素，E-選擇素mRNA的相對(duì)表達(dá)很低，而LPS明顯上調(diào)了選擇素的相對(duì)表達(dá)量，給藥組選擇素mRNA表達(dá)均下降，高劑量組的基因表達(dá)顯著下降。

Figure.4 relative expression of the select-E

Figure.5 relative expression of the select-P

3.6 Western blot法測(cè)NF-κB蛋白表達(dá)

如圖6，7，與對(duì)照組比較，LPS模型組的NF-κB P65，P-IκB蛋白表達(dá)條帶顏色加深，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。從數(shù)據(jù)可以看出，總黃酮低中高劑量組能明顯降低LPS損傷后的NF-κB P65，P-IκB1蛋白表達(dá)量的上調(diào)，成劑量依賴性，在25 μg/mL時(shí)達(dá)到頂峰。木犀草苷高中低劑量組也能明顯降低蛋白表達(dá)量，但是和總黃酮高中低劑量組比較，沒(méi)有總黃酮組作用效果明顯。

Figure.6 NF-KB P65注：圖從左到右共有8條帶，依次為：1：空白對(duì)照組；2：LPS 10 μg/mL；3：總黃酮25 μg/mL；4：總黃酮12.5 μg/mL；5：總黃酮6.25 μg/mL；6：木犀草苷25 μg/mL；7：木犀草苷12.5 μg/mL；8：木犀草苷6.25 μg/mL。

Figure.7 GAPDH

注：圖從左到右共有8條帶，依次為：1：空白對(duì)照組；2：LPS 10 μg/mL；3：總黃酮25 μg/mL；4：總黃酮12.5 μg/mL；5：總黃酮6.25 μg/mL；6：木犀草苷25 μg/mL；7：木犀草苷12.5 μg/mL；8：木犀草苷6.25 μg/mL。

Figure.8 p-IKBα注：圖從左到右共有8條帶，依次為：1：空白對(duì)照組；2：LPS 10 μg/mL；3：總黃酮25 μg/mL；4：總黃酮12.5 μg/mL；5：總黃酮6.25 μg/mL；6：木犀草苷25 μg/mL；7：木犀草苷12.5 μg/mL；8：木犀草苷6.25 μg/mL。

組別(μg/mL)GAPDHNF-KBP65NF-KBP65/GAPDHratetoK無(wú)血清空白14840003893760.26240.3675LPS1013153339389570.71391總黃酮2515703334909360.31260.4379總黃酮12.514636666296690.43020.6026總黃酮6.2515536668417440.54180.7589木犀草苷2515703335022670.31980.4481木犀草苷12.513920006842530.49160.6886木犀草苷6.2513240007554640.57060.7993

Figure.9 GAPDH

注：圖從左到右共有8條帶，依次為：1：空白對(duì)照組；2：LPS 10 μg/mL；3：總黃酮25 μg/mL；4：總黃酮12.5 μg/mL；5：總黃酮6.25 μg/mL；6：木犀草苷25 μg/mL；7：木犀草苷12.5 μg/mL；8：木犀草苷6.25 μg/mL。

表7 p-IκBα蛋白表達(dá)結(jié)果(n=3)

4 討論

下肢深靜脈血栓(DVT)形成是常見(jiàn)的周圍血管疾病,中醫(yī)古典醫(yī)學(xué)著作將本病歸于“脈痹”“血疲證”“腫脹”“疲血流注”等范疇[6-7]。DVT發(fā)生是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜過(guò)程，隨著對(duì)血栓性疾病的深入研究,特別是對(duì)細(xì)胞分子水平的研究,除了Vierhow[8]靜脈血栓發(fā)病三大因素外,還發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)與血栓形成有密切的關(guān)系。血管細(xì)胞的功能紊亂和炎癥反應(yīng)是其發(fā)生的重要誘因。正常靜脈內(nèi)皮具有抗血栓形成的功能,但在靜脈損傷情況下或靜脈內(nèi)環(huán)境發(fā)生混亂時(shí),可轉(zhuǎn)化為血栓前狀態(tài),產(chǎn)生細(xì)胞因子,增加靜脈內(nèi)皮滲透性,誘導(dǎo)細(xì)胞黏附,炎癥因子的表達(dá)如IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子(TNF-α)等。

LPS(脂多糖,也稱內(nèi)毒素)[9-10]是革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁組分，是誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)和功能紊亂的重要因素之一。本實(shí)驗(yàn)采用LPS誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞，成功建立了細(xì)胞炎癥損傷模型，結(jié)果表明LPS 可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)炎癥細(xì)胞因子和黏附分子等，影響細(xì)胞生長(zhǎng)周期，使細(xì)胞周期滯留在G1期。總黃酮和木犀草苷低中高劑量能夠使HUVEC增殖，有效抑制LPS對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖的影響，能夠明顯降低細(xì)胞內(nèi)炎癥因子IL-6，IL-8，TNF-α，VCAM-1等的含量，降低通路蛋白的表達(dá)，對(duì)LPS導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)有很好的保護(hù)作用。

源于蓬子菜中的總黃酮組分和木犀草苷單體對(duì)炎癥損傷的作用為高劑量組優(yōu)于中劑量組優(yōu)于低劑量組，總黃酮組優(yōu)于木犀草苷組，此結(jié)果可能是由于總黃酮組能有效抑制炎癥反應(yīng)發(fā)生的多個(gè)通路。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明蓬子菜中成分對(duì)深靜脈血栓的前期炎癥反應(yīng)有保護(hù)作用，這也為進(jìn)一步闡明蓬子菜治療血栓的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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Protective Effect of Active Compound from Galium verum L. on HUVEC Inflammatory Injury Induced by LPS

NING Xin, DONG Kun, SUN Chao, MA Ying-li*

(HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective: To observe the protective effect of galuteotin and flavonoids from Galium verum L. on HUVEC inflammatory injury induced by LPS. Methods: The method called CCK-8 was used to detect the influence of drugs on the proliferation of HUVEC. The influences of different LPS concentrations on the cell cycle were compared by FCM (flow cytometry). Use ELISA to detect the influence of LPS on the generation of inflammation factor after giving drugs. The expression levels of E-selection and P-selection mRNA were measured by RT-PCR. Western blot was used to detect the protein expression of NF-κB, p-Iκ-B. Results: When the concentrations of drugs were 6.25, 12.5, 25 μg/mL respectively, the proliferation rate was the best. The drugs had an obvious effect on decreasing the secretion of the inflammation factor in the HUVEC induced by LPS. Meanwhile,they could decrease the relative expression of E-selection and P-selection and the protein expression of NF-κB, P-IκB. Conclusion: The inhibitive effect of LPS presents time-dependence and dose-dependence. The injury is obviously improved after giving galuteotin and flavonoids from Galium verum L.

Flavone of Galium verum L; Galuteotin; Inflammation; Human umbilical endothelial cells; Lipopolysacharide

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No．201281274034)； 教育部博士點(diǎn)博導(dǎo)類基金資助項(xiàng)目(No.20112327110006)

寧馨(1990-)，女，研究生，主要研究方向：中藥及復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

馬英麗*(1954-)，女，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥及復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ),質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究。

2016-05-20

R285.5

A

1002-2406(2017)01-0017-05

修回日期：2016-06-10