免疫性血小板減少癥病證結合動物模型研究

郎海燕，褚雨霆，馬薇 ，張雅月 ，陳信義*

(1.北京中醫藥大學東方醫院，北京 100078；2.北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700)

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模 型 研 討

免疫性血小板減少癥病證結合動物模型研究

郎海燕1，褚雨霆2，馬薇2，張雅月2，陳信義2*

(1.北京中醫藥大學東方醫院，北京 100078；2.北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700)

目的：探討非附加條件建立免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenic purpura, ITP)病證結合動物模型的可行性。方法：對3批ITP模型小鼠相關數據進行了綜合分析,并按照病證結合模型辨識標準，評估注射APS的被動性免疫造模法復制的小鼠模型是否能夠模擬人類ITP發病過程與臨床特征。結果：注射APS復制的ITP模型小鼠特征如下：1)模型小鼠外周血小板計數下降、凝血時間延長，與正常組比較，有統計學意義(P<0.01)。2)骨髓產板巨核細胞減少，與正常組比較，有統計學意義(P<0.05、0.01、0.001)。3)模型小鼠注射APS部位或其他部位有自發性出血。4)造模1周后模型小鼠即有活動減少，行動遲緩，不思飲食，進食(水)量明顯減少，大便溏稀，皮膚瘀斑、瘀點，皮膚或注射部位自發性出血，并隨造模時間延長，上述表征日趨加重。結論：在非附加任何條件下，注射APS的被動免疫造模法復制的ITP動物模型符合病證結合模型特征，從而為開展中藥藥理學實驗提供了理想的研究工具。

免疫性血小板減少癥；脾(氣虛)不統血證；病證結合動物模型

目前，病證結合是中醫臨床重要的診療模式，其特點是既注重對疾病的診斷與治療，又重視對中醫證候的辨證施治[1]。在中醫研究領域，在研究一組中藥能否用于治療疾病，或要探討臨床療效很好的一組作用機理時，需要建立相應的動物模型予以證實。但由于在動物實驗中不能充分運用中醫四診理論(缺少問診、切診與舌診)，復制的動物模型多為疾病模型，而缺乏中醫證候表征[2]。為解決這一難題，通常在慢性疾病基礎上，研究者需要施加其他干預方法建立一個病加證或證加病的動物模型。這種模型與疾病發生、進展之間有一些差距。就此，我們提出了“既然能夠復制疾病模型，就可以通過模型小鼠的某些外在表征觀察，找到與人類疾病相似的中醫證候特征”[3]。基于這一假設，我們對3批非附加任何干預條件復制的ITP小鼠模型的相關數據進行了綜合分析，并按照擬定的ITP病證結合模型辨識標準，評估注射APS的被動性免疫造模法復制的ITP小鼠模型是否能模擬人類ITP發病過程與臨床特征。

1 病證結合模型辨識標準

1.1 疾病模型辨識標準

具備以下4條可判定符合疾病模型標準：1)外周血血小板計數下降；2)注射或其他部位出血或自發性皮膚瘀斑；3)凝血時間延長；4)骨髓產板巨核細胞減少。

1.2 證候模型辨識標準

基于人類ITP發病特點，結合實驗小鼠行為學特征和部分定量檢測指標，將用于人體的“氣不攝血證”外在表現轉換為類似實驗動物的“脾不統血證”行為學表征，轉換指標包括：1)注射或其他部位出血或自發性皮膚瘀斑為病與證共性特征；2)活動減少類似于神疲乏力；3)行動遲緩類似于肢體倦怠；4)不思飲食、進食與飲水量減少、大便溏稀類似于脾虛或脾氣虛；5)體質量下降類似于脾虛，不主肌肉。

1.3 病證結合模型辨識標準

依據疾病與證候模型辨識指標，具備疾病模型辨識標準4條中的3條以上(第1必備)，結合證候模型辨識標準5條中任意3條，即可判定為病證結合模型。

2 實驗方法

2.1 抗小鼠血小板血清制備

抗小鼠血小板血清制備步驟：1)取BALB/c小鼠，乙醚麻醉后，從小鼠心臟取全血，以EDTA-Na2抗凝，分離血小板并洗滌，用生理鹽水稀釋。2)取已分離的血小板分別與等量完全福氏佐劑和不完全福氏佐劑混合成油包水狀作抗原，以含完全福氏佐劑抗原于0周注射豚鼠足掌、背及皮下，至少四點；以含不完全福氏佐劑抗原分別于l、2、4周按上述相同部位與點數注射。第5周從豚鼠心臟取不抗凝全血，560 g×10 min離心后取上清，即得豚鼠抗小鼠血小板血清(GP-APS)，并貯存于-20℃冰箱待用。3)參照ELISA法加以改進，用國產凍干酶聯A蛋白純品代替堿性磷酸酶-蛋白A酶標抗體檢測抗血清效價。4)將APS從-20℃中取出，置56℃水浴30 min，用等量BALB/c小鼠紅細胞吸附至少兩次，用生理鹽水稀釋成1∶4濃度APS備用。

2.2 實驗動物分組

每批實驗動物均采用SPF級健康BALB/c小鼠，體質量為18～22 g，8周齡，雌雄各半。每批實驗前從24只小鼠尾靜脈取血，用全自動血細胞計數儀檢測小鼠外周血小板計數后，隨機分2組，每組12只。正常組常規飼養；模型組于1、3、5、7、9、11、13天，按照100 μl/20 g劑量向小鼠腹腔內注入1∶4稀釋的APS造模，并在動態觀察各項指標變化，于第15天處死小鼠，取骨髓涂片檢測相關指標。

2.3 觀察指標

主要觀察指標如下：1)疾病模型指標：血小板計數、出血情況、凝血時間、骨髓巨核細胞分類。2)證候模型指標：動態觀察模型小鼠行為學與體質量變化。

2.4 統計學處理

3 結果

3.1 疾病模型指標變化

3.1.1 血小板計數

實驗結束后，從尾靜脈取血80 μl，加入帶有EDTA-Na2固體抗凝劑試管,使血液與抗凝劑充分混合后，用全自動血細胞計數儀檢測血小板計數。3批實驗結果見表1。從表1可以看出，造模成功后，模型小鼠外周血血小板數值明顯下降，與同批實驗正常組比較，有統計學意義(P<0.01)。

組別第1批(n)第2批(n)第3批(n)正常組967.00±301.30(12)542.80±116.13(10)552.00±114.00(9)對照組618.1±192.10*(11)313.60±77.69*(10)314.00±78.00*(10)

注：與正常組比較，*P<0.01。

3.1.2 出血情況比較

在實驗過程中，經連續、動態觀察發現，注射APS后第3天皮下可見密集的鮮紅出血點，皮下瘀斑融合成片，持續時間大約3～4天。于造模1周后出血逐漸減輕，出血顏色也由鮮紅逐漸轉為暗紅，類似人類ITP慢性出血表現。3批實驗模型小鼠出血情況分別見圖1～3。

圖1 第1批實驗：模型小鼠腹部、四肢出血

圖2 第2批實驗：模型小鼠耳緣出血

圖3 第3批實驗：模型小鼠足趾出血腫脹

3.1.3 凝血時間比較

實驗結束時取一小滴眼球血于表面皿中，用注射器針頭尖端不斷挑撥，記錄到出現血絲為止的時間(秒)。3批實驗凝血時間檢測結果見表2。從表2可以看出，實驗結束后，模型小鼠凝血時間延長，與同批實驗正常組比較，有統計學意義(P<0.01)。

組別第1批(n)第2批(n)第3批(n)正常組62.66±6.71(12)61.60±2.88(10)61.60±2.88(10)對照組90.81±8.70*(11)81.90±4.12*(10)81.90±4.12*(10)

注：與正常組比較，*P<0.01。

3.1.4 骨髓巨核細胞分類變化

實驗結束后處死動物，剝離小鼠，取胸骨骨髓，用25 μl小牛血清混勻，迅速涂片，風干后做瑞氏染色，用顯微鏡(10×100) 順序計數100個巨核細胞并分類(原始巨、幼稚巨、顆粒巨、產板巨、裸巨)。3批實驗結果見表3。從表3結果可以看出，與同批實驗正常組比，1)模型小鼠骨髓產板巨核細胞明顯減少(P<0.01)；2)第2、第3批實驗模型小鼠骨髓裸核細胞均有下降(P<0.01)。

實驗批次組別(n)原、幼稚巨裸核巨顆粒巨產板巨第1批正常組(12)6.25±1.4827.41±5.0558.16±5.028.16±2.25模型組(11)4.18±1.33△30.63±4.5060.00±3.665.18±1.83*第2批正常組(10)28.90±5.226.30±2.4556.80±5.778.10±1.85模型組(10)32.20±5.903.70±1.42△58.9±5.495.20±1.48▲第3批正常組(10)28.90±5.226.30±2.4556.80±5.778.10±1.85模型組(10)32.20±5.903.70±1.42△58.90±5.495.20±1.48△

注：與正常組比較，*P<0.05，△P<0.01,▲P<0.001。

3.2 證候模型觀察

3.2.1 小鼠行為學變化

正常組小鼠在飼養過程中始終反應靈活，毛色光潤，喜活動，主動覓食，大便呈條狀。模型小鼠于注射APS后1周表現活動減少，行動遲緩，不思飲食，進食(水)量明顯減少，大便溏稀，皮膚瘀斑、瘀點，皮膚或注射部位自發性出血，并隨造模時間延長，上述表征日趨加重。

3.2.2 體質量比較

3批實驗模型小鼠體質量檢測結果見表4。從表4可以看出，第1、2、3批實驗造模后1周兩組小鼠體質量變化不大，造模后2周，模型小鼠體質量明顯減輕，與正常組、造模前比較，有統計學意義(P<0.05)。

實驗批次分組(n)造模前造模后1周造模后2周第1批正常組(12)18.63±2.3318.95±1.1421.17±1.81模型組(11)20.21±1.5117.69±1.5217.18±1.94*第2批正常組(10)20.10±0.7421.30±0.8221.80±0.79模型組(10)20.00±0.8219.50±0.6718.70±0.95*第3批正常組(20)24.3±2.5223.35±2.1621.00±1.38對照組(20)23.93±2.6622.07±1.6420.65±1.35*

注：與正常組、造模前比較，*P<0.05。

3.3 病證結合模型判定

基于以上實驗結果，依據擬定的ITP病證結合模型辨識標準判定，ITP模型小鼠除有明顯的注射部位和皮膚自發性出血、外周血小板數值下降、凝血時間延長、骨髓產板巨核細胞減少疾病模型特征外，還具有模型小鼠活動減少、行動遲緩、不思飲食、大便溏稀、毛失光澤、皮膚瘀斑(出血)、體質量減輕等外在證候表征。

4 討論

按照疾病急緩程度，將免疫性血小板減少癥(Immune thrombocytopenic purpura，ITP)分為急性ITP(Acute immune thrombocytopenic purpura，AITP)與慢性ITP(Chronic immune thrombocytopenic purpura，CITP)兩種類型[4]。基于中醫理論，結合臨床表現，AITP多見于兒童，因其發病急、血小板嚴重降低、出血量大等，屬中醫“血熱妄行”證候；CITP特征表現為起病緩慢、病程漫長、血小板減少伴有慢性出血，屬中醫“氣不攝血”證候[5-6]。通過長期臨床實踐，中醫藥在治療CITP方面具有明顯的治療優勢，主要表現在中藥能夠改善患者臨床癥狀，緩解出血傾向，提升外周血小板計數[7-8]。但中醫藥治療ITP的臨床實際中，我們要證實按照中醫理論擬定的一組中藥應用于臨床是否有效，或說明一組臨床有效的中藥治療ITP作用機制時，需要建立能夠模擬人類ITP發病過程與臨床特征，且穩定性好、可重復的動物模型。但從目前已經發表的文獻分析，僅有ITP疾病模型，缺乏既符合疾病特點，又符合證候表現的病證結合模型[9-10]。有基于此，我們擬定了ITP病證結合模型辨識標準，并試圖通過以被動性免疫造模法復制的3批ITP動物模型相關數據進行分析與總結，判定是否與人類ITP發病特點及其證候具有一致性，從而為臨床應用中醫的健脾益氣攝血法則治療ITP提供參考。

對3批實驗結果分析顯示：注射APS復制的ITP模型小鼠具有下列特征：1)模型小鼠外周血小板計數下降、凝血時間延長，與正常組比較，有統計學意義(P<0.01)。2)骨髓產板巨核細胞減少，與正常組比較，具有統計學意義(P<0.05、0.01、0.001)。3)模型小鼠注射APS部位或其他部位均有自發性出血。4)造模1周后模型小鼠即有活動減少，行動遲緩，不思飲食，進食(水)量明顯減少，大便溏稀，皮膚瘀斑、瘀點，皮膚或注射部位自發性出血，并隨造模時間延長，上述表征日趨加重。按照預先擬定的ITP病證結合模型辨識標準判定，注射APS的被動免疫造模法復制的ITP模型小鼠具有與人類ITP發病相似的疾病與證候特征。

以注射APS的被動性免疫造模法復制ITP動物模型具有技術成熟度高、操作簡便、重復性好、干擾因素少、成本相對較低等優勢[11-12]。但非附加條件建立ITP病證結合動物模型研究至今還在探索之中。我們既往也嘗試過不施加任何人為干預方法，建立免疫性血小板減少性紫癜“氣虛血瘀”病證結合動物模型，但因血瘀指標選擇難度較大，血瘀證據相對不足，其準確度還在進一步評估[13]。在本文中除擬定了ITP小鼠疾病模型辨識指標外，還擬定了ITP模型小鼠證候辨識標準與轉換指標，并按照病證結合模型辨識標準對各項數據進行歸納與分析證明，注射APS的被動免疫造模法復制的ITP模型小鼠檢測的客觀指標不但與人類ITP發病特點一致，其外在表征(中醫證候)也與人類ITP有高度的相關性。證明了“非附加條件可以復制與人類ITP發病相似的病證結合動物模型”。同時，通過分析在實驗過程中連續、動態觀察結果發現，注射APS后第3天模型小鼠皮下和注射部位可見密集的鮮紅色出血點，皮下瘀斑融合成片，持續大約3～4天后，出血顏色逐漸轉為淡紅或暗紅。在這一暫短的變化過程中，模型小鼠依然存在著明顯活動減少、行動遲緩、不思飲食、食(飲水)量減少、體質量下降等表征，我們無法用“血熱妄行證候”來合理解釋，有待通過實驗進一步觀察和總結。

對于上述結果與結論也存在一些需要商榷與改進的問題：1)目前尚無公認的ITP病證結合動物模型辨識標準，我們擬定的證候診斷條件是否確切，有待進一步改進與完善。2)APS屬外源性抗體，并非來源于研究對象自身。當停止注射APS后，模型小鼠外周血小板低水平維持時間較短，是否為預防用藥的最佳動物模型[14]，需待進一步證實。3)雖然本文檢測的各項指標均有陽性結果，如外周血小板數值下降、骨髓產板巨核細胞減少、不同程度出血以及具有與人類ITP發病相似的臨床證候表現。但其他造模方法是否也具有上述特征需要提供更多的實驗證據[15-16]。4)作為最有說服力的抗血小板抗體、血小板膜糖蛋白(Ⅱa與Ⅲb)在該模型中是否有表達以及該指標檢測意義，待通過研究予以證實。因此，在今后的研究中，將用較大的動物(豚鼠或家兔)復制ITP動物模型，以保證有足夠的血液標本用于指標檢測。

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Disease-syndrome Combined Animal Models for Immune Thrombocytopenic Purpura

LANG Hai-yan1, CHU Yu-ting2, MA Wei2, ZHANG Ya-yue2, CHEN Xin-yi2*

(1.DongfangHospital,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100078,China;2.DongzhimenHospital,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100700,China

To explore the feasibility of establishing the disease-syndrome combined animal models for immune thrombocytopenic purpura (ITP) without additional conditions. Methods: Three batches of data related to the ITP model mice obtained by replication at different time were overall analyzed, and whether the APS-injected model mice replicated through the passive immune modeling method could simulate the pathogenesis and clinical characteristics of human ITP was evaluated according to the differentiation criteria for disease-syndrome combined models. Results: The APS-injected replicated ITP model mice possessed the following characteristics: ①Compared with the normal group, the platelet count was significantly decreased, and coagulation time was significantly increased in the model group (P<0.01). ②Compared with the normal group, the medullary thrombocytogenous megakaryocytes were significantly decreased (P<0.05, 0.01, 0.001). ③The APS injected sites and other parts of model mice had spontaneous hemorrhage. ④Behavioral changing signs were observed after 1 week of modeling,with low activity, delayed activity, poor appetite, skin petechia/hemorrhage and spontaneous hemorrhage of injected sites and other parts, and became more and more severe. Conclusion: According to the syndrome differentiation criteria for disease-syndrome combined models of ITP, the APS-injected animal models of ITP replicated through the passive immune modeling method without additional conditions possess the characteristics of disease-syndrome combined models. It provides an ideal tool for the development of pharmacology experiment in traditional Chinese medicine.

Immune thrombocytopenic purpura; Syndrome of spleen failing to manage blood due to the spleen Qi deficiency; Disease-syndrome combined animal models

國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)(No.2013CB531705)

郎海燕(1979-)，女，博士，講師，副主任醫師，主要研究方向：中醫藥治療血小板疾病應用研究。

陳信義*(1954-)，男，教授，主任醫師，博士研究生導師，主要研究方向：中西醫結合防治惡性腫瘤及血液系統疾病。

2016-04-28

R285.5

A

1002-2406(2017)01-0039-05

修回日期：2016-05-10