酸棗仁湯對抑郁模型大鼠海馬β-catenin表達影響的實驗研究

田旭升，李欣，王瓏，張家瑞，郭宏偉*

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040)

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酸棗仁湯對抑郁模型大鼠海馬β-catenin表達影響的實驗研究

田旭升1，李欣1，王瓏2，張家瑞1，郭宏偉1*

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：觀察酸棗仁湯對抑郁大鼠模型海馬β-catenin表達的影響。方法：復制慢性輕度不可預見性應激抑郁大鼠模型，測定其體質量、糖水消耗及行為學得分，采用Western-Blot檢測大鼠海馬中β-catenin的表達。結果：抑郁模型大鼠體質量增長速度減慢，糖水消耗減少，行為學測試分減少，海馬內β-catenin表達減少，酸棗仁湯高劑量組可上調β-catenin的表達。結論：酸棗仁湯可增加β-catenin的表達，減少神經元細胞凋亡，具有抗抑郁作用。

抑郁癥；酸棗仁湯；β-catenin

抑郁癥現作為一種危害嚴重的精神疾病之一，具有高發病率、高致殘率、易復發、自殺傾向等特點。WHO的全球疾病負擔合作研究預測，到2020年抑郁癥將成為全球第二位醫療疾患[1]。抑郁癥不僅使患者健康受到損害，生活質量下降，而且給家庭，社會造成極大負擔，因此抑郁癥已成為一個嚴重的社會和醫療問題。可見，對抑郁癥的防治研究迫在眉睫。

中醫對抑郁癥的認識與研究比較早，在治病方法與研究上積累了豐富的經驗[2-5]。中醫藥多環節，多靶點的藥理特點也越來越廣泛的應用在抑郁癥的防治上[6-7]。酸棗仁湯出自《金匱要略》，具有顯著的療效[8-9]。本實驗通過復制大鼠抑郁模型，從而觀察酸棗仁湯對抑郁大鼠海馬內的β-catenin(β-鏈蛋白)表達的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

清潔級健康雄性SD大鼠48只，體質量(180±50)g，由黑龍江中醫藥大學動物實驗中心提供，合格證號：SCXK(黑)2014-0008，大鼠所需的專用飼料，由黑龍江中醫藥大學動物實驗中心所提供，高壓滅菌處理實驗大鼠所需飼料。

1.2 實驗藥品及制備

酸棗仁、茯苓、知母、甘草、川芎購于哈爾濱人民同泰藥店，經鑒定符合2015年版《中國藥典》。酸棗仁湯的劑量參考《金匱要略》原方為依據，按照常規方法煎煮制成水煎劑，濃縮至0.5 g/ml、1.0 g/ml、2.0 g/ml，放置于4℃冰箱保存備用。生理鹽水、氟西汀購于哈爾濱人民同泰藥店;兔抗多克隆二抗PV6001、DAB顯色劑購于北京中山公司;其他試劑為國產分析純。

1.3 實驗器材

上海恒電熱恒溫箱、恒溫冰箱(日本三洋電器有限公司)；低速自動平衡離心機(LDZ-2型)；電擊箱(北京醫科院藥研所)；石蠟切片機萊卡2135型(德國)；美國moticam3000顯微攝影成像系統；電子天平(沈陽龍騰電子公司)；醫學數碼圖像分析系統(麥奧迪克廈門公司)。

2 實驗方法

2.1 分組及給藥

將48只大鼠適應性飼養3天后，根據體質量和open-field評分，隨機分成空白組、模型組、氟西汀組、酸棗仁湯低、中、高劑量組，每組8只，于造模7天后，連續灌胃21天。大鼠給藥量，按人與大鼠等效劑量關系換算，按照10 ml/kg劑量，空白組和模型組給予0.9%蒸餾水灌胃，氟西汀組給予0.36 mg/ml氟西汀混懸液灌胃，酸棗仁湯低中高劑量組分別給予濃度為0.5 g/ml、1.0 g/ml、2.0 g/ml的酸棗仁湯灌胃，6組均每日灌胃1次。

2.2 抑郁模型復制

空白組每籠飼養8只，實驗過程中不接受任何刺激。其余組別的大鼠每籠1只進行孤養，在實驗的21天內，進行7種不同的慢性應激，每天1種，相同的應激刺激不連續應用。應激方法根據Banasr[10]方法略微改進，具體包括：禁水12 h，禁食12 h，傾斜鼠籠，熱刺激，冰水游泳，潮濕飼養，晝夜顛倒。

2.3 指標測定

2.3.1 體質量測量

于實驗的第0，21天測量大鼠體質量，觀察并測量各組大鼠體質量所發生的變化，進行統計學分析，分析體質量與抑郁的顯著性關系。

2.3.2 糖水消耗試驗

此實驗利用大鼠對糖水的喜好，反應大鼠內源性快感缺失的程度。于實驗的第0，21天開始進行，在進行糖水實驗前24 h，對各組大鼠禁食、禁水，將大鼠的飲用水更換成1%濃度的蔗糖水，每瓶150 ml，做好稱量計算，12 h后記錄所有瓶中蔗糖水量的剩余數值，做差值計算出糖水消耗量，進行統計學處理。

2.3.3 行為學檢測

于實驗的第0，21天開始進行，于大鼠測量完體質量后進行行為學測試，準備測試裝置為長、寬各1 m、高0.8 m的木箱，底部設置為25個16 cm×16 cm的小方格。檢測過程中要保證減少額外干擾，例如時間、溫度、光照、及環境噪音等的干擾。正式檢測前，操作者應熟練掌握檢測標準，減少人為誤差。計算得分由2人或2人以上的操作者完成，1人負責觀察記錄計時，1人負責記錄大鼠活動得分。計算得分方式是：垂直活動得分為前肢抬起、后肢直立為準，計1分，水平活動得分以大鼠四肢共同處于1個方格內為準，計1分。測量時，首先應將大鼠放置在箱子中心處，統計3 min內大鼠水平活動和垂直活動得分總和。

2.3.4 大鼠海馬β-catenin表達檢測

于實驗第21天，大鼠稱量體質量及行為學測試后，快速斷頭剝離海馬，按照100 mg/ml加入200 μl RIPA裂解液，加入蛋白酶抑制劑后勻漿；冰上靜止1 h，于4 ℃ 12 000 r/min離心30 min；提取上清液測定總蛋白濃度，置-80 ℃冰箱凍存備用；含25 μg總蛋白樣品經SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉移到PVDF膜上；TBST配制5%脫脂奶粉室溫封閉1 h加小鼠β-catenin單克隆抗體4 ℃冰箱中孵育過夜；加入羊抗兔二抗，羊抗小鼠二抗室溫孵育2 h；孵育完后TBST漂白10 min×3次；將膜用P10-LightHRP化學發光液室溫孵育5 min后封入保鮮膜，暗室內壓入膠片曝光顯影。每次檢測時都檢測β-actin，以β-catenin與內參β-actin的灰比度進行比較，對顯影結果進行掃描，進行統計學分析。

2.4 統計處理

3 結果

3.1 酸棗仁湯對抑郁大鼠模型體質量的影響

結果見表1，第0天各組大鼠體質量無明顯差異(P>0.05)，第21天后，與空白組相比 ，模型組體質量明顯下降(P<0.01)；與模型組相比，酸棗仁湯低，中劑量組體質量明顯增加(P<0.05)，酸棗仁湯高劑量組和氟西汀組體質量顯著增加(P<0.01)。

組別n第0天第21天空白組8201.50±7.37245.38±7.4**模型組8198.00±4.89205.35±8.65ΔΔ氟西汀組8202.48±3.41241.28±5.42**酸棗仁湯低組8205.02±3.11230.30±4.29ΔΔ*酸棗仁湯中組8204.02±7.84234.05±9.52Δ*酸棗仁湯高組8204.63±3.12243.94±4.88Δ**

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01； 與空白組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

3.2 酸棗仁湯對抑郁大鼠模型糖水消耗的影響

結果見表2。第0天各組大鼠糖水消耗無明顯差異(P>0.05)。第21天后，與空白組相比，模型組糖水消耗量顯著減少(P<0.01)；與模型組相比，各給藥組糖水消耗量均明顯增加(P<0.05)。

組別n第0天第21天空白組885.53±7.52161.68±32.04**模型組883.55±8.6039.958±12.94ΔΔ氟西汀組880.28±8.55120.608±10.54*酸棗仁湯低組889.18±7.418102.73±38.38*酸棗仁湯中組888.828±7.358112.33±82.63*酸棗仁湯高組882.028±9.43108.13±23.62*

注：與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01； 與空白組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

3.3 酸棗仁湯對抑郁大鼠模型行為學的影響

結果見表3。第0天，各組大鼠行為學得分無明顯差別(P>0.05)；第21天，與空白組相比，模型組行為學得分顯著降低(P<0.01)，出現類似為抑郁癥的癥狀，從行為學角度證明抑郁癥模型造成功。與模型組相比，酸棗仁湯低，中劑量組行為學得分明顯升高(P<0.05)，酸棗仁湯高劑量組和氟西汀組行為學得分顯著升高(P<0.01)。

組別n第0天第21天空白組8102.73±12.8995.75±6.13**模型組8102.00±13.4424.51±6.02ΔΔ氟西汀組8110.24±12.3282.73±14.87**酸棗仁湯低組8104.25±7.6844.00±9.48ΔΔ*酸棗仁湯中組8111.52±11.8470.59±13.38Δ*酸棗仁湯高組8101.08±8.9898.25±14.41Δ**

注：與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01； 與空白組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

3.4 酸棗仁湯對抑郁大鼠模型海馬β-catenin相對蛋白表達量的影響

結果見表4。與空白組相比，模型組大鼠海馬β-catenin相對蛋白表達水平顯著性降低(P<0.01)；與模型組相比，氟西汀組、酸棗仁湯高、中劑量組大鼠海馬β-catenin相對蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)。結果見表4。

組別n(β-catenin/β-actin)×100%空白組43.06±0.56**模型組40.75±0.22ΔΔ氟西汀組42.72±0.10**酸棗仁湯低組41.56±0.26ΔΔ*酸棗仁湯中組42.13±0.98**酸棗仁湯高組42.58±0.37**

注：與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01；與空白組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

3.5 酸棗仁湯對抑郁大鼠模型海馬β-catenin的表達影響

結果見圖1。與空白組相比，模型組大鼠海馬β-catenin蛋白的表達條帶明顯變細，表明β-catenin蛋白表達減少；與模型組相比，各給藥組的蛋白條帶明顯變粗，表明β-catenin蛋白表達增多，說明氟西汀組，酸棗仁湯各劑量組可改善β-catenin蛋白的表達。

圖1 各組大鼠模型海馬β-catenin與β-action的蛋白表達比較注：1.模型組；2.空白組；3.氟西汀藥組；4.酸棗仁湯低組；5.酸棗仁湯中組；6.酸棗仁湯高組。

4 討論

通過β-catenin的表達與抑郁癥的關系研究發現，Wnt信號通路作為腦內調控神經元發育轉導的重要信號通路，Wnt信號通路轉導取決于細胞內β-catenin的水平，Wnt信號通路轉導的關鍵是胞質中是否存在結構穩定的β-catenin[11]。在神經干細胞分化方面，通過研究發現轉基因小鼠進行體內實驗，其穩定活化的β-catenin基因能夠促進神經髓干細胞分化成為感覺神經元。若β-catenin發生突變后，可導致感覺神經元大量流失，說明β-catenin在調控神經干細胞分化成感覺神經元方面起到重要作用。海馬腦區β-catenin含量增加，能夠快速產生抗抑郁效應[12]。

酸棗仁湯作為治療虛煩虛眠虛寐的經典名方，具有有效的抗抑郁作用。本實驗通過復制慢性輕度不可預見性應激抑郁大鼠模型，應用酸棗仁湯對抑郁模型大鼠海馬β-catenin的表達做了相關研究。結果表明模型組大鼠體質量增長速度緩慢，糖水消耗較治療組減少，行為學測試得分減少。模型組大鼠海馬相對蛋白表達量顯著性降低，其β-catenin的表達降低，而酸棗仁湯高劑量組可提高β-catenin的表達，優于酸棗仁湯低、中劑量組，起到良好的抗抑郁作用。因此可認為酸棗仁湯抗抑郁機制可能與促進神經元生存，抑制海馬神經元細胞凋亡減少腦損傷密切相關。

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國家自然科學基金項目(No.81303044)

田旭升(1976-)，男，博士，副研究員，碩士研究生導師，主要研究方向：中醫藥干預精神疾病。

郭宏偉*(1966-),男，教授，碩士研究生導師，醫學博士，主要研究方向：中國醫學史，中國醫學現代轉型研究中精神疾病相關研究。

2016-08-30

R285.5

A

1002-2406(2017)01-0052-03

修回日期：2016-09-10