夾脊電針聯合甲基強的松龍對大鼠急性脊髓損傷后神經細胞凋亡表達的實驗研究

李曉寧，梁雪松，遲蕾，劉雙嶺，臧召霞，李諾，梅繼林

(1.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江省醫院，黑龍江 哈爾濱 150001)

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夾脊電針聯合甲基強的松龍對大鼠急性脊髓損傷后神經細胞凋亡表達的實驗研究

李曉寧1，梁雪松2，遲蕾2，劉雙嶺1，臧召霞3，李諾2，梅繼林2

(1.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江省醫院，黑龍江 哈爾濱 150001)

目的：探討夾脊電針聯合甲基強的松龍治療對大鼠急性脊髓損傷后受損組織的病理學改變及神經細胞凋亡表達的影響。方法：Wistar大鼠隨機分為6組，用改良Allen’s打擊法制成脊髓損傷模型，分別進行HE和TUNEL染色，檢測大鼠受損組織病理形態學的改變及神經細胞凋亡的表達。結果：HE染色顯示，急性脊髓損傷組大鼠1 d時出血明顯，3 d時神經細胞破壞最明顯，7 d時神經細胞凋亡有所減輕，14 d時凋亡已不明顯，尤以夾脊電針聯合甲基強的松龍組神經細胞保存較完好。TUNEL染色顯示，與急性脊髓損傷組相比，術后3 d、7 d、14 d，急性脊髓損傷+夾脊電針組、急性脊髓損傷+甲基強的松龍組、急性脊髓損傷+夾脊電針治療+甲基強的松龍組、急性脊髓損傷+抑制劑組神經細胞凋亡均減少(P<0.05)。術后7 d、14 d，急性脊髓損傷+夾脊電針治療+甲基強的松龍組神經細胞凋亡減少明顯(P<0.05)。結論：急性脊髓損傷后7 d、14 d時，夾脊電針聯合甲基強的松龍可以抑制大鼠急性脊髓損傷后神經細胞凋亡及神經細胞病理形態學異常改變。

急性脊髓損傷；大鼠；夾脊電針；甲基強的松龍

急性脊髓損傷(acute spinal injury，ASCI)是臨床上的常見且嚴重的神經系統疾病，嚴重威脅著患者的健康和生命[1]。目前國際通用的指南推薦中提到ASCI患者早期大劑量給予糖皮質激素是治療本病的首選治療方案，但因其副作用較大，常常伴有嚴重并發癥，而未得到患者的廣泛認可[2]。隨著近些年對急性脊髓損傷深入研究，夾脊電針作為一種傳統的康復治療手段，在臨床應用和實踐中取得了較好的療效，本研究從時效性觀察夾脊電針聯合甲基強的松龍對大鼠急性脊髓損傷后受損組織的病理形態學改變及神經細胞凋亡的影響，探討其治療急性脊髓損傷的機理。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

144只Wistar雌性大鼠，體質量(200±10)g，隨機平均分為6組：假手術組(Sham組)、急性脊髓損傷組(ASCI組)、急性脊髓損傷+夾脊電針治療組(EA組)、急性脊髓損傷+甲基強的松龍組(MP組)，及急性脊髓損傷+夾脊電針治療+甲基強的松龍組(EA+MP組)，急性脊髓損傷+抑制劑組(MDL28170組)，每組再分為1天、3天、7天、14天四個亞組。每個亞組為6只。

1.2 主要實驗儀器設備

1.2.1 實驗主要儀器 見表1。

表1 實驗所用主要儀器

1.2.2 實驗主要試劑及生產公司 見表2。

表2 主要試劑及其生產公司

1.2.3 主要配制試劑及其配制方法 見表3。

表3 主要配制試劑及其配制方法

1.3 造模方法

采用美國Impactor Model-Ⅲ spinal cord contusion system 打擊器，計算機程控下精確打擊制作大鼠 ASCI 模型(T10,中度損傷)。用10%水合氯醛腹腔麻醉(3.5 ml/kg)，俯臥固定，選取后背正中切口，將大鼠固定于打擊器基座上，打擊棒以10 g×50 mm勢能撞擊以T10為中心段脊髓，造成該段的急性脊髓中度損傷，生理鹽水沖洗傷口及清除殘留血液，傷口部位常規分層縫合，選擇BBB評分在1～3分入組。

1.4 治療方法

Sham組：手術后常規飼養，正常捆綁，其余不予任何處置。

ASCI組：模型制備成功后單籠飼養，正常捆綁，其余不予任何處置。

EA組：于模型制備成功后3 h進行夾脊電針早期干預治療，此后每日1次，直至療程結束。針刺穴位選取T9、T11節段夾脊穴。將0.35 mm×13 mm毫針直刺入所選穴位下4～5 mm，給予電針儀脈沖連續波，脈沖寬度：(0.5±0.15)ms，頻率為100 Hz，脈沖峰值為Vp1≥(40±10) V(在500 Ω負載下)，刺激時長為30 min/次/日。

MP組：術后30 min時，給予實驗大鼠一次性注射甲基強的松龍。甲基強的松龍按30 mg/kg，與0.9 g/L生理鹽水配置成0.5 ml注射液，給予大鼠腹腔注射；正常捆綁，其余不予任何處置。

EA+MP組：夾脊電針治療方法同上，治療次數同上；甲基強的松龍用法與治法同上。正常捆綁，其余不予任何處置。

MDL28170組：術后30 min腹腔注射MDL 28170(1 mg/kg)，此后每天同一時間點分別注射，直到療程結束。正常捆綁，其余不予任何處置。

1.5 取材

大鼠在實驗治療結束后，依照相對應打擊損傷時間進行麻醉，然后斷頭處死，于冰盒上快速取出損傷處脊髓，長度約4 cm，從損傷中心處迅速切開，置入4%多聚甲醛緩沖液中固定后4℃冰箱待測。

1.6 觀察指標

組織病理學形態變化：經切片脫蠟至水、染色、脫水、透明、封片、鏡檢等步驟進行HE染色并鏡下觀察。

神經細胞凋亡：經透化、PBS漂洗、封閉、Labeling、蘇木素復染、脫水、透明、封片鏡檢等步驟觀察神經細胞凋亡。

1.7 統計學處理

2 實驗結果

2.1 HE染色觀察脊髓組織病理學形態變化

ASCI組大鼠1 d時出血明顯，可見大量凋亡神經細胞；3 d時細胞破壞最明顯，可見大量凋亡神經細胞，核仁消失，核固縮；7 d時神經細胞凋亡有所減輕，神經細胞壞死，正常神經細胞數量減少，膠質細胞增生，炎性細胞浸潤；14 d時凋亡已不明顯，可見空泡存在，其余4治療組神經細胞損傷情況較ASCI組明顯減輕，尤以EA+MP組神經細胞保存較完好。

圖1 各組大鼠的HE染色 (200×)注：B.ASCI組；C.EA組；D.MP組；E.EA+MP組；F.MDL組；1. 1 d時間點；2. 3 d時間點；3. 7 d時間點；4. 14 d時間點。

2.2 TUNEL法檢測脊髓組織神經細胞凋亡

TUNEL檢測可見，Sham組未見明顯神經細胞凋亡，與EA組、MP組、EA+MP組、MDL28170組相比，具有顯著差異(P<0.05)。與ASCI組相比，術后3 d、7 d、14 d，EA組、MP組、EA+MP組、MDL28170組神經細胞凋亡減少，差異顯著(P<0.05)。與EA組、MP組、MDL28170組比較，術后7 d、14 d，EA+MP組神經細胞凋亡減少，差異顯著(P<0.05)，詳見表1。

組別1d3d7d14dSham1.83±0.983.00±1.672.17±1.172.00±1.26ASCI7.67±3.2021.50±1.8718.33±2.3414.33±4.76EA9.00±1.7912.83±2.32▲10.67±2.73▲8.50±5.82▲MP9.67±2.1613.00±2.00▲10.83±2.23▲9.33±3.39▲EA+MP8.67±1.6311.17±3.31▲7.50±3.39▲△2.50±1.05▲△MDL6.50±1.8711.50±1.87▲10.33±2.25▲8.50±1.05▲F11.67841.50927.78910.755P<0.001<0.001<0.001<0.001

注：與ASCI組比較，▲P<0.05；與EA組、MP組和MDL組比較，△P<0.05。

3 討論

急性脊髓損傷嚴重影響患者生活質量，其致殘率和死亡率極高。現代醫學認為繼發性損傷是導致急性脊髓損傷肢體功能障礙的主要原因之一，其機制包括血管痙攣、血栓形成、微循環障礙、水腫、自由基形成、興奮性氨基酸生成等[3]。近年研究證實神經細胞凋亡導致神經元大量丟失是引發急性脊髓繼發性損傷的重要病理機制。他通過兩個階段發揮作用：初始階段，凋亡伴隨著壞死發生；晚期階段，則主要局限于白質中包括少突膠質細胞[4]，受損細胞微環境發生變化，影響各種促進凋亡和抑制凋亡的因子的表達[5]。甲基強的松龍是目前治療脊髓損傷的常用藥物，近年來國內外對其治療ASCI作用機制進行了廣泛的研究，研究表明甲基強的松龍具有多方面的神經保護作用，包括改善微循環、抑制脂質過氧化、減少細胞鈣內流、維持神經元興奮性等[6-8]。張強，廖維宏等[9]利用原位末端脫氧核糖核苷酸轉移酶介導dUTP標記法及免疫組化SP法觀察大劑量應用甲基強的松龍對大鼠脊髓損傷區細胞凋亡的影響，發現早期應用大量甲基強的松龍不僅減輕大鼠脊髓損傷后脊髓水腫、微環境改變，而且可以阻止或減輕脊髓神經細胞凋亡。

中醫學認為急性脊髓損傷的病機為督脈受損，導致與其及相關聯的經絡、臟腑功能紊亂，病位主要與督脈、腎經有關[10]。夾脊電針是中醫治療急性脊髓損傷的重要手段，夾脊穴循行于脊柱，內夾督脈，外循膀胱，其下為脊神經后支及靜脈分布，電刺激可直接作用于脊髓及包膜，形成電場可改善損傷區微環境，促進脊髓纖維再生。王振宇,孫忠人等[11-12]通過動物實驗觀察電針夾脊穴對脊髓損傷大鼠皮層體感誘發電位的影響及其對神經功能恢復的促進作用，發現電針夾脊穴對脊髓損傷大鼠神經功能恢復起促進作用，先期電針干預的效果好于后期。李曉寧等[13]觀察夾脊電針對大鼠脊髓繼發性損傷后c-fos mRNA及BNIP3 mRNA表達及其變化規律的實驗中證實了夾脊電針能促進脊髓損傷后功能的恢復及抑制神經細胞凋亡。本實驗通過建立ASCI大鼠模型，應用MP及MDL28170作為陽性對照藥物，對比分析夾脊電針與MP、MDL28170對ASCI大鼠神經細胞凋亡的影響，證實了在急性脊髓損傷后7 d、14 d時，EA+MP可以抑制大鼠急性脊髓損傷后神經細胞凋亡及神經細胞病理形態學異常改變，在治療ASCI上優于兩者單獨治療，為臨床治療急性脊髓損傷患者提供新思路。

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國家自然科學基金(面上)項目(No.81373715)

李曉寧(1969-)，女，主任醫師，博士研究生導師，主要研究方向：針灸治療神經系統疾病。

2016-09-05

R246

A

1002-2406(2017)01-0092-04

修回日期：2016-10-04