豬星狀病毒2型PCR檢測分型方法的建立及初步應用

羅 璋，羅季委，李海錦，賀巨炬，彭 旺，李潤成，余興龍，肖朝庭

（1.湖南農業大學動物醫學院，湖南長沙410128；2.湖南大學生物學院，湖南長沙410082）

豬星狀病毒2型PCR檢測分型方法的建立及初步應用

羅 璋1，羅季委1，李海錦1，賀巨炬1，彭 旺1，李潤成1，余興龍1，肖朝庭2※

（1.湖南農業大學動物醫學院，湖南長沙410128；2.湖南大學生物學院，湖南長沙410082）

根據GenBank登的豬星狀病毒2型（PAstV2）序列，設計1對引物。通過優化反應條件，首次在湖南地區檢測到PAstV2型病毒。用該方法通過提取樣品RNA，采用RT-PCR進行擴增，得到一條預期的特異性條帶（243bp），將擴增產物進行測序分析，結果表明該序列與PAstV2型的參考序列同源性為96％。同時，用該引物檢測可引起腹瀉的PEDV、TGEV、CSFV和PRRSV四種病毒RNA，RT-PCR結果均為陰性。該RT-PCR的敏感性試驗結果表明其最高敏感度為400 pg/μL。采用該方法對湖南境內78份豬腸道和糞便樣品進行檢測，發現PAstV2型的感染率達到11.5％（9/78）。結果表明該方法可以應用于臨床PAstV2檢測。

豬星狀病毒；基因型；PCR；PAstV2

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與病料

豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬流行性腹瀉病毒（PEDV）由湖南農業大學動物醫學院預防獸醫實驗室保存；豬瘟病毒（CSFV）和豬藍耳病病毒（PRRSV）來自于普萊科生物疫苗毒；78份豬糞便和腸道收集于湖南不同地區的豬場。

1.1.2 主要試劑

RNA抽提試劑Trizo1Reagent購自Invitrogen公司；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas公司；Taq DNA聚合酶Mix購自天恩澤生物有限公司；無R N A酶水購自生工生物工程有限公司，其他常規試劑均為國產，分析純。

1.1.3 樣品處理

取病豬的糞便0.2g，加入1mL無RNA酶水，用旋渦混合儀震蕩混勻后，放入高速臺式冷凍離心機12 000r/min離心5min，取上清液至-20℃冰箱貯存。……