脂質體在體外消化過程中的氧化穩定性

田蒙蒙,李 娜,魏富強,盧筠夢,韓劍眾,劉瑋琳

(浙江工商大學食品與生物工程學院,浙江省食品安全重點實驗室,浙江杭州 310035)

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脂質體在體外消化過程中的氧化穩定性

田蒙蒙,李 娜,魏富強,盧筠夢,韓劍眾,劉瑋琳*

(浙江工商大學食品與生物工程學院,浙江省食品安全重點實驗室,浙江杭州 310035)

分別建立成人和嬰兒體外胃、腸單獨消化模型以及胃腸連續消化模型,通過檢測脂質過氧化物值(POV)和硫代巴比妥酸(TBARS)反應物濃度,研究脂質體在模擬消化過程中的氧化穩定性。結果表明,脂質體在模擬人體單獨胃消化過程中結構保持穩定,而在模擬小腸環境易受胰酶和膽鹽的作用發生氧化,并且在模擬胃中和模擬腸中嬰兒的POV和TBARS值均顯著低于成人(p<0.05);在連續消化過程中,模擬嬰兒胃部消化時間對其繼續在小腸消化的氧化程度影響較小(p>0.05),而模擬成人胃腸連續消化產生的過氧化物量相對較多,脂質體氧化程度比較高,結構破壞較嚴重。

脂質體,體外消化,脂質氧化,穩定性

脂質體(Liposome)是脂類分子(類脂)的自組裝體,具有一個或多個類似生物膜的雙分子層,中間包覆微水相的結構,是一種被廣泛研究的遞送系統[1-2]。脂質體可由天然存在或人工合成的磷脂為原料制備獲得,具有保護、靶向、長效、無毒等優點,且工藝相對簡單、易擴大生產、供給途徑多樣化[3-4]。自1965年發現以來,脂質體已廣泛應用于食品營養、醫藥、化妝品、農業等領域[5]。然而,脂質體的不穩定性和氧化降解限制了其應用[6]。前期研究表明,脂質體在模擬體外胃部消化過程中結構基本保持穩定,而在小腸消化過程中磷脂雙層膜逐漸水解[7],但對脂質體在胃腸環境的氧化行為并未深入研究。另外,由于嬰兒消化系統發育不完全,消化道中pH、酶含量等消化環境與成人有很大差別[8],針對脂質體在嬰兒胃腸環境以及成人胃腸環境氧化穩定性的報道研究鮮見。

脂質氧化作用是發生在不飽和脂肪酸共價鍵上的一系列自由基反應,其產生的活性氧易使細胞膜的流動性和通透性發生改變,導致細胞結構的破壞和功能的減弱,甚至引起DNA損傷,影響人體健康[9-10]。脂質體主要壁材為磷脂,據Grit[11]描述,脂質體中磷脂的氧化主要作用在多不飽和磷脂酰基鏈上,同時受到磷脂分子中脂肪酸鏈的飽和度以及溶液中存在的離子強度的影響。而脂質體處于低酸環境如胃酸更易發生氧化反應,產物含有帶負電荷的脂肪酸等物質,直接影響脂質體的包封率,也可能增加毒性[12]。因此,檢測脂質體氧化代謝產物對評價脂質體的結構穩定性和食品安全性具有重要意義[13-14]。

因此,本文以通過脂質過氧化物值(POV)和硫代巴比妥酸反應物(TBARS)濃度為評價指標,分別建立嬰兒及成人胃腸消化模型,系統探討脂質體在模擬成人及嬰兒胃腸道消化過程中氧化穩定性,以期研究以脂質體為營養素運載體系的食品以及藥品在胃腸道消化方面的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆磷脂(P3644)、胃蛋白酶(P7000)、胰酶(P1750)、膽鹽(B8631)、維生素E(T3251;≥96%)、膽固醇(C8503;≥92.5%)、吐溫-80 Sigma公司;磷酸氫二鈉(≥99%)、磷酸二氫鈉 Aladdin公司;實驗用水(Water) Milli-Q去離子水(≥98%);三氯乙酸(TCA)、碳酸氫銨、硫氰酸銨、二叔丁基對甲酚(BHT)、無水乙醇 均為分析純。

ARA 520電子精密天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司;85-2數顯恒溫磁力攪拌器 江蘇省金壇市江南儀器廠;R-200旋轉蒸發儀 瑞士Buchi公司;TQ2-312臺式恒溫振蕩器 上海精宏實驗設備有限公司;Synergy UV超純水儀 法國 Millipore儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 嬰兒及成人模擬胃腸消化液配制 模擬胃液(Simulated gastric fluid,SGF)和小腸液(Simulated intestinal fluid,SIF)的配制方法參照Liu[15]和Dupont[16]等的報道并加以改進(表1)。SGF儲備液的配制:稱取2 g氫氧化鈉溶于約800 mL的去離子水,用0.1 mol/L HCl調節pH后定容至1 L;SIF儲備液的配制:準確稱取6.8 g磷酸氫二鉀溶于800 mL去離子水,用0.1 mol/L NaOH調節pH后定容至1 L。

表1 嬰兒與成人模擬胃腸道消化液配方

注:“/”表示不含此物質。

1.2.2 脂質體的制備 脂質體的制備采用經典薄膜分散法即Bangham法并進行改良,具體步驟為[17]:將磷脂、膽固醇、吐溫-80和維生素E按質量比為6∶1∶1.8∶0.12溶解于無水乙醇并于30 ℃水浴恒溫避光攪拌過夜,均勻的混合液于旋轉蒸發儀抽真空除去無水乙醇(55 ℃水浴),待形成均勻薄膜后,緩慢加入磷酸鹽緩沖溶液PBS(pH7.4,0.05 mol/L),在低速旋轉條件下充分洗膜至少1 h,形成乳白色懸液即得脂質濃度為8 mg/mL的LF脂質體。制備過程全程避光,所得樣品于4 ℃條件下避光保存。

1.2.3 體外模擬胃、腸單獨消化 將脂質體與成人或嬰兒SGF或SIF儲備液按照1∶3(v/v)混合后,分別調節SGF混合液的pH至3(嬰兒)或1.5(成人)、SIF混合液的pH至7.4,在37 ℃恒溫水浴搖床中以95 r/min預熱20 min。根據Kristinova等[18]的方法并做適當修改,將混合液轉移至帶有少許玻璃珠的注射器內,輕輕搖晃將其混合均勻(注意保持活塞和注射器管口的封閉);在注射器中預留5 mL的空氣,以保證在整個氧化過程中氧氣充足。將注射器放置于37 ℃恒溫搖床,以95 r/min的轉速混勻,避光;加入胃蛋白酶或胰酶的瞬間開始計時,每隔30 min(0、30、60、90、120 min)從注射器中取樣1 mL于具塞試管中,經胃消化的樣品滴加0.5 mol/L碳酸氫銨調節pH至7.0±0.5、經模擬小腸消化樣品在95 ℃加熱2 min使酶滅活,立刻進行指標測定。

1.2.4 體外模擬胃腸連續消化 根據Ye[19]等方法做適當修改,建立嬰兒體外模擬胃腸連續消化模型。首先按照1.2.3所述進行模擬胃消化,分別在1、30、120 min取樣,與配制好的嬰兒或成人SIF儲備液混合,然后按照1.2.3所述進行模擬小腸消化,分別在0、30、60、120 min處取樣并滅酶,立刻進行指標測定。

1.2.5 硫代巴比妥酸反應物(TBARS)的測定 根據Zhang[20]的方法,取0.205 mL模擬消化后的脂質體,加入0.3 mL的2% BHT乙醇溶液和10 mL的TBA/TCA儲備液,其中,TBA/TCA儲備液由15% TCA(w/v)和0.375% TBA(w/v)組成。然后將混合樣品置于沸水浴中煮沸15 min,取出后冷卻至室溫,采用紫外分光光度法測量反應產物在532 nm處的吸光值,至少重復3次實驗,每次實驗平行3個樣品,由公式(1)計算得到TBARS值。

式(1)

其中,Abs是反應物吸光度,f是樣品的稀釋倍數(200),ε是吸收系數(156000 L/mol·cm),L是光路寬(1 cm),V是脂質體體積(mL),G是脂質總質量(kg)。

1.2.6 過氧化物值(Peroxide value,POV)的測定 取0.1 mL的脂質體消化樣品,依次加入5 mL的96%乙醇、0.2 mL的4% BHT乙醇溶液,置于旋渦震蕩器中充分混合,然后再加入0.1 mL濃度為0.4 mol/L的硫氰酸銨-乙醇溶液(2 mol/L的HCl作為溶劑)和0.1 mL濃度為4.5 mmol/L的FeSO4·7H2O(2 mol/L的HCl作為溶劑),搖勻并靜置10 min后立刻在500 nm波長條件下測定吸光度,至少重復3次實驗,每次實驗平行3個樣品。測量前樣品保持在冰水浴,并且試劑需用氮氣進行脫氣處理。通過公式(2)計算得到POV值[18]。

式(2)

其中,ABSt是反應物吸光值,ABS0為空白溶液的吸光值,V為脂質體的體積(mL),S是標準曲線的斜率(μg),G是0.16 mL中磷脂的質量(g),55.845是鐵離子的摩爾質量(g/mol),1000用于單位轉換,2為校正因子。

1.3 數據統計分析

實驗所得數據采用SPPS 19.0和Origin 9.0等數據處理和繪圖軟件進行分析作圖,以p<0.01 為差異極顯著,p<0.05為差異顯著的判斷標準。結果均以平均值±標準偏差表示。

2 結果與討論

2.1 脂質體在模擬胃部消化的氧化穩定性

本文通過檢測POV值(FTC法)和硫代巴比妥酸反應物的生成量(TBARS法)來評價脂質體氧化程度。

FTC法主要用于檢測氧化初期產生的脂過氧化物,不能反映氧化終止;TBARS值主要表明氧化終端產物丙二醛的量,但不能反映氧化開始及中間狀態。因此,兩種方法共同使用更能全面說明脂質體在模擬胃腸道消化過程中的氧化應激效應。

由圖1(a)分析脂質體在模擬胃消化的氧化程度發現,無論是成人組還是嬰兒組,隨著消化時間的增加,POV值變化不明顯(p>0.05),略呈現先上升后下降的趨勢,在1.5 h達到最大值(2.88±0.10)mmol/kg(嬰兒)和(3.61±0.14) mmol/kg(成人);在整個模擬消化過程中成人環境脂質體的POV值均高于嬰兒(p<0.05)。由圖1(b)可知,嬰兒和成人TBARS值也略有逐漸增高的趨勢,成人組在1.5 h達到最大值(0.64±0.01) mmol/kg;并且嬰兒TBARS值均亦比成人小。

圖1 脂質體在模擬嬰兒和成人胃部消化過程中POV(a)和TBARS(b)含量的變化Fig. 1 POV(a)and TBARS(b)values of liposomes during in simulated gastric infant and adult digestion

據Halliwell[21]等和Kanner[22]的研究報道,胃腸道環境中的強酸、酶、膽鹽、鹽離子能促進脂質的氧化。本研究發現,模擬嬰兒和成人消化的POV值與TBARS總體變化不明顯(p>0.05),說明胃的低酸環境影響不是很大,可能是由于膽固醇在低pH下能有效保護脂質體不受破壞,使得脂質體結構變化較小[23]。POV值隨消化時間延長而出現先增大后減少的趨勢,可能是由于脂過氧化物是磷脂的初級氧化產物,本身化學性質不穩定,經過一定積累后,能分解為醛、酮、酸、醇等低分子量化合物[24]。而嬰兒的POV值和TBARS值都顯著比成人小(p<0.05),可能是因為嬰兒SGF的pH相對較高(嬰兒pH3.0,成人pH1.5),pH影響反應物的反應性、溶解性和在兩相間的分配以及界面電荷,從而影響脂質體的氧化穩定性。另外有研究表明,在pH為3～7之間,脂質氧化速度隨pH的升高而減小[25-26];同時,嬰兒胃中蛋白酶的含量較成人少,脂質體破壞小,體系中分散的氧、水溶性自由基等物質與脂肪酸鏈接觸概率降低[27],以上因素使得脂質體在模擬嬰兒環境氧化程度低于成人環境。

2.2 脂質體在模擬小腸消化的氧化

由圖2(a)可知,脂質體在模擬嬰兒和成人的SIF中發生不同程度的氧化。隨著消化時間的延長,脂質體的POV值逐漸增大,1 h后基本保持在(6.28±0.1) mmol/kg(嬰兒)和(7.32±0.06) mmol/kg(成人),TBARS值的變化趨勢與POV值類似(圖2(b)),消化1 h后亦基本不變,嬰兒和成人保持在(0.81±0.03)mmol/kg和(1.12±0.05) mmol/kg。整個消化過程模擬成人環境的POV值和TBARS值均大于嬰兒環境(p<0.05),而且氧化程度都明顯高于模擬胃部。

圖2 脂質體模擬嬰兒和成人小腸消化POV(a)和TBARS(b)值隨時間的變化 Fig. 2 PV(a)and TBARS(b)values of liposomes as a function of time during in simulated intestinal infants and adults digestion

小腸胰酶為一種混合酶,主要包括胰脂肪酶、磷脂酶A2和膽固醇酯酶,這三種酶都能導致磷脂發生水解[28]:胰脂肪酶可以水解磷脂的脂肪酸鏈,釋放出脂肪酸和1-酰基溶血磷脂;磷脂酶A2可以破壞磷脂的磷酸二酯鍵生成甘油磷酸和2-酰基溶血磷脂;膽固醇酯酶類似于膽鹽刺激酯酶可催化膽固醇的水解。另外,膽鹽是較強的類表面活性劑,能破壞磷脂的膜結構,導致脂質體膜穩定性降低,流動性增大[29],從而使得磷脂薄膜更容易發生氧化降解。在模擬嬰兒SIF中,酶和膽鹽的濃度較成人低,對脂質體破壞較小,故而TBARS值和POV值均比成人SIF低(p<0.05)。再者,脂質體在SIF環境消化過程中的POV值與TBARS值均顯著高于SGF環境(p<0.05),可能是因為到達腸中的脂質體受到多種酶的催化,導致脂質體氧化更加徹底。

2.3 脂質體在模擬胃和小腸連續消化的氧化穩定性

脂質體經過模擬胃部消化后進入模擬小腸繼續消化,環境發生很大變化,包括酶種類、離子(膽鹽)以及pH[30]。其中,pH從胃部的1.5～3.0升高到6.0～7.5,而且因不同強度電解質的存在使模擬消化環境中離子強度也發生變化[31]。因此,脂質體在模擬胃腸連續消化過程中脂質氧化程度更復雜。圖3為脂質體在模擬嬰兒胃腸中連續消化的POV值變化趨勢。結果顯示,在模擬嬰兒胃中消化30 min后繼續在模擬小腸消化0、30、60和120 min的POV值分別為(3.10±0.10)、(3.60±0.30)、(3.61±0.20)和(3.80±0.08) mmol/kg,變化不明顯(p>0.05)。因此,隨著模擬胃部消化時間的延長,繼續在模擬小腸中消化的平均POV值略呈下降趨勢,但總體變化不明顯。

圖3 脂質體在模擬嬰兒胃腸連續消化過程中POV的變化Fig. 3 Changes in POV of liposomes during in simulated infant stomach-subsequent-intestine digestion

圖4為脂質體在成人環境中模擬連續消化過程的POV值變化。脂質體在模擬成人胃中消化30 min后在模擬小腸消化0、30、60和120 min后的POV值分別為(2.16±0.02)、(6.01±0.09)、(6.37±0.15)和(6.54±0.40) mmol/kg,明顯呈上升趨勢。脂質體在模擬成人胃中消化60、120 min后又分別在模擬小腸消化30、60和120 min的平均POV值為(4.56±0.30)、(3.25±0.10) mmol/kg。由此可見,脂質體在模擬成人胃中消化相同時間,繼續在模擬小腸消化初期,POV值明顯升高(p<0.05),30 min之后,變化不明顯。但是隨著在胃部消化時間的增加繼續在模擬小腸中消化,其平均POV值呈明顯下降趨勢(p<0.05),說明模擬成人胃部消化過程影響脂質體在模擬小腸中的氧化程度。相比圖3中的POV值變化,脂質體在模擬連續胃腸消化的脂質氧化程度更激烈,氧化程度變化更明顯,原因可能是模擬成人胃液中胃蛋白酶含量高、模擬成人小腸環境中胰酶和膽鹽的濃度高,同時過氧化物是磷脂的初級氧化產物,經過一定積累后會繼續分解,因此氧化程度較高,變化較大。

圖4 脂質體在模擬成人胃腸連續消化的PV值隨時間變化Fig.4 Changes in POV of liposomes as a function of time during in simulated adult digestion in SGF followed by in SIF

脂質體在模擬嬰兒胃腸連續消化的TBARS變化趨勢與POV值類似。由圖5可知,脂質體在模擬嬰兒胃中消化30、60、120 min后分別在模擬小腸消化0、30、60、120 min的平均TBARS值分別為(0.64±0.02)、(0.63±0.01)、(0.60±0.01) mmol/kg,隨著在模擬胃部消化時間的延長,繼續在模擬小腸中消化的平均TBARS值變化不明顯(p>0.05)。此結果再次說明,在模擬嬰兒胃腸連續消化過程中,脂質體在模擬胃部的消化時間,對其在模擬小腸后續消化過程中的氧化程度影響較小,產生的過氧化物量也較少,同時也表明在模擬嬰兒胃腸道連續消化之后脂質體結構破壞相對較小。

圖5 脂質體在模擬嬰兒胃腸消化的TBARS值隨時間變化Fig. 5 Changes in TBARS of liposomes as a function of time during in simulated infant stomach-subsequent-intestine digestion

圖6為脂質體在模擬成人胃腸連續消化的TBARS值變化。脂質體在模擬成人胃中消化30 min后在模擬小腸消化0、30、60 和120 min的TBARS值分別為(0.54±0.02)、(1.13±0.11)、(1.16±0.05)、(1.21±0.05) mmol/kg。在模擬小腸中消化30 min的TBARS值明顯高于消化0 min的TBARS值(p<0.05),而且繼續在模擬小腸消化30、60、120 min的TBARS值略有增大但變化不明顯(p>0.05)。再者,脂質體在模擬胃中消化60、120 min后分別在模擬小腸消化30、60、120 min TBARS值呈現下降的趨勢(p<0.05),說明胃部消化過程影響脂質體在小腸的氧化。相比圖5中模擬嬰兒TBARS值,脂質體在模擬成人連續胃腸消化脂質氧化程度更激烈,可能是由于模擬成人SGF的pH更低、胃蛋白酶、胰酶和膽鹽含量更高,脂質氧化相對徹底。

圖6 脂質體在模擬成人胃腸消化的TBARS值隨時間變化Fig. 6 Changes in TBARS of liposomes as a function of time during in simulated adult stomach-subsequent-intestine digestion

3 結論

胃腸是營養成分的主要消化吸收場所,通過測量模擬腸胃中脂質氧化水平,不僅可以判斷脂質體在胃腸消化過程中的穩定性,還可以評價胃腸連續消化之后的過氧化物生成量。單獨消化時,脂質體在模擬人體胃液消化過程中相對穩定,形成的氧化產物較少;但在模擬小腸環境中,脂質體易發生氧化。連續消化時,模擬嬰兒胃部消化時間,對脂質體在模擬小腸消化過程中的氧化程度影響較小;而由于模擬成人小腸環境中胰酶和膽鹽的含量比嬰兒高,脂質體在模擬成人環境消化產生的過氧化物量較多,穩定性較低。該研究結果可為脂質體在胃腸道消化的安全性評價和添加入嬰兒配方食品提供理論參考。

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Oxidative stability of liposomes duringinvitrodigestion

TIAN Meng-meng,LI Na,WEI Fu-qiang,LU Jun-meng,HAN Jian-zhong,LIU Wei-lin*

(Food Safety Key Laboratory of Zhejiang Province,School of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University,Hangzhou 310035,China)

Invitroseparately simulated infant gastric and intestinal model and stomach-subsequent-intestine model were established in this paper,with adult conditions as comparison. In order to evaluate the oxidative stability of liposomes during simulated digestion,the proxide value and the concentration of thiobarbituric acid reaction substances were determined. Separation digestion results demonstrated that liposomes were stable during digestion in simulated gastric environment,while they were susceptible to be oxidized in simulated intestinal environment. In stomach-subsequent-intestine study,liposomes were less affected by oxygen,low pH and enzyme. However,more peroxides were formed and more severe disruption of liposomes were detected under adult conditions due to the higher concentration of pancreatic enzymes and bile salts in the adult than those in the infant environment.

liposome;invitrodigestion;lipid oxidation;stability

2016-05-06

田蒙蒙(1991-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：食品質量與安全專業，E-mail：971468842@qq.com。

*通訊作者:劉瑋琳(1984-)，女，博士，講師，研究方向：營養物及其運載體系的生物利用，E-mail：lwl512@zjgsu.edu.cn。

國家自然科學基金青年科學基金項目(31401482)；浙江省食品科學與工程重中之重一級學科開放基金項目(JYTSP20142011)；浙江省公益技術應用研究計劃項目(2016C32060)；浙江省科技創新活動計劃暨新苗人才計劃(1110KZN0215114G)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)22-0154-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.022