白及多糖的超聲-微波協同提取工藝及其抗氧化活性研究

蔡錦源,熊建文,黃燕芬,趙耀胤,張彩云,劉煒煒,韋坤華,*

(1.廣西科技大學鹿山學院,食品與化學工程系,廣西柳州 545616;2.廣西藥用植物園,廣西藥用資源保護與遺傳改良重點實驗室,廣西南寧 530023;3.平南中等職業技術學校,廣西平南 537300)

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白及多糖的超聲-微波協同提取工藝及其抗氧化活性研究

蔡錦源1,2,熊建文1,黃燕芬2,趙耀胤3,張彩云1,劉煒煒1,韋坤華2,*

(1.廣西科技大學鹿山學院,食品與化學工程系,廣西柳州 545616;2.廣西藥用植物園,廣西藥用資源保護與遺傳改良重點實驗室,廣西南寧 530023;3.平南中等職業技術學校,廣西平南 537300)

超聲-微波協同提取,白及,多糖,抗氧化活性

中藥白及為蘭科植物白及(Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.)的干燥塊莖,具有收斂止血、消腫生肌之功效,臨床上廣泛用于治療咳血、吐血、潰瘍疼痛、手足皸裂等癥,具有抑菌、抗腫瘤等生物活性[1-5]。現代研究表明白及的主要藥用成分為白芨膠,又稱白及多糖[6]。目前白及多糖主要以提取為主,提取方法主要有熱水浸提法[7]、超聲波提取法[8]和酶提取法[9]和紅外輻射提取法[10],這些提取方法存在提取時間長、產品品質低和提取率低等缺點。Qu Y[10]和芮海云等[11]對白及多糖的抗氧化活性進行了研究,但研究結果存在較大差異,有必要進一步實驗驗證。

文獻報道超聲-微波協同提取技術可有效提高有效成分的提取效率[12-14],但目前尚未有關白及多糖的超聲-微波協同提取的研究報道。本研究旨在以白及多糖得率為指標,采用單因素和正交實驗優選白及多糖的超聲-微波協同提取工藝條件,并對白及多糖的體外抗氧化活性進行研究,以期為優選白及多糖的提取方法提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白及 購自玉林藥材市場,經廣西藥用植物園林楊助理研究員鑒定為蘭科植物白及的塊莖;苯酚、濃硫酸、乙醇、石油醚、葡萄糖、VC、雙氧水、1,1-二苯基-2-苦肼基、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、硫酸亞鐵、水楊酸等 國產分析純。

UV-5100紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;JY1002(0.01 g)電子天平 上海精密科學儀器有限公司;FW100高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;CW-2000型超聲-微波協同萃取儀 超聲波功率/頻率:50W(固定)/40 kHz,微波功率/頻率:0～1000W(任意可調)/2450 MHz,上海新拓分析儀器科技有限公司;HH-S21-6 數顯恒溫水浴鍋 金壇市醫療儀器廠;TDL-80-2B低速離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 白及多糖的提取工藝路線 白及→干燥(50 ℃)→預處理(石油醚脫脂為2倍體積回流提取2 h,脫色為2倍體積80%乙醇，常溫浸泡3 h后干燥)→粉碎→過篩(60目)→稱量→超聲-微波協同提取(超聲功率為50 W)→真空抽濾→濃縮→醇沉(加4倍95%乙醇)→離心(3000 r/min,20 min)過濾后復溶脫蛋白→二次醇沉得粗多糖。

1.2.2 總糖標準曲線的制作(苯酚-硫酸法) 采用苯酚-硫酸法[15]測定總糖濃度。以吸光度為縱坐標,總糖質量濃度為橫坐標,繪制總糖的標準曲線,回歸方程為:A=66.61429X-0.014,R2=0.9999。表明線性關系良好,線性范圍為0.0025～0.0175 mg/mL。

1.2.3 白及多糖的含量測定及其得率的計算方法 將白及粉末(2.00 g)按方法“1.2.1”進行提取,制備的粗多糖溶解并定容,按方法“1.2.2”,以空白校正零點,于490 nm處測定其吸光度,根據總糖標準回歸方程計算總糖濃度,按式(1)計算總糖含量,多糖得率按式(2)計算[16]:

W=N×X/1000

式(1)

Y(%)=W/M×100

式(2)

其中:W為總糖含量,g;N為稀釋倍數;X為總糖濃度,mg/mL;Y為白及多糖得率,%;M為白及投料質量,g。

1.2.4 單因素實驗 精密稱取2.00 g白及樣品粉末,開啟超聲開關,超聲波功率為50 W,其余4個因素條件設定為液料比20∶1 mL/g,浸泡時間8 min,微波功率250 W和微波時間4 min,固定其中3個因素條件,分別考察各因素對白及多糖得率的影響,各因素考察水平分別為液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1 mL/g),浸泡時間(0、2、4、6、8、10、12 min),微波功率(50、100、150、200、250、300 W),微波時間(2、3、4、5、6、7 min)。

1.2.5 正交實驗設計 在單因素實驗的基礎上,采用正交設計表L9(34)對超聲-微波協同提取的影響因素進行正交實驗設計,實驗因素與水平見表1。

表1 正交設計實驗因素與水平

1.2.6 相互作用方式分析 在正交設計優選的最優工藝條件的基礎上,將超聲-微波協同提取與單獨超聲波輔助、單獨微波輔助提取進行比較[12],分析協同提取高效的原因。具體參數設置如表2所示。

1.2.7 白及多糖體外抗氧化活性的測定

1.2.7.1 ·OH的清除率的測定 采用Fenton法[17-18]分別測定白及多糖和VC對·OH的清除率,即配制不同質量濃度(0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL)的多糖樣品溶液,在試管中依次加入0.09 mol/L FeSO4溶液、0.09 mol/L水楊酸-乙醇溶液,搖勻后加入

表2 白及多糖超聲-微波協同提取相互作用分析

質量濃度不一樣的多糖溶液,最后加入0.08 mol/L H2O2溶液啟動反應,37 ℃水浴1 h。冷至室溫后定容到10 mL,用蒸餾水調零,在波長510 nm處測吸光度,每組做3個平行樣,取平均值。在其他條件不變的情況下,改動三種試劑做相應實驗:以蒸餾水替換多糖溶液做空白對照;以VC替換多糖溶液作為陽性對比;以蒸餾水替換H2O2溶液測多糖本底液吸光度。按式(3)計算·OH清除率。

清除率(%)=[A0-(Ax-Ax0)]/A0×100

式(3)

式中:A0-空白對照吸光度;Ax-樣品溶液吸光度;Ax0-樣品本底液吸光度。

1.3 數據統計分析

將得到的實驗結果利用Excel、正交設計助手V3.1和Origin7.5對實驗結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 液料比對多糖得率的影響 由圖1可知,隨著液料比從10∶1增加到20∶1時,多糖得率迅速增大,液料比為20∶1時多糖得率達到最大值,但當液料比增加至20∶1以后,多糖得率上升趨勢非常緩慢,并有下降趨勢,原因可能是在其他操作條件相同的情況下,適當增大液料比有利于多糖溶出,但是液料比過大,在一定的微波功率和提取時間下,微波作用反而降低,不利于破壞細胞膜和細胞壁,多糖溶出減弱,多糖得率反而下降[20],故液料比以20∶1為宜。

圖1 液料比對多糖得率的影響Fig.1 Effects of liquid/solid ratio on polysaccharide yield

2.1.2 浸泡時間對多糖得率的影響 由圖2可知,隨著浸泡時間的不斷增加,多糖得率也顯著增加,但當浸泡時間6 min之后,多糖得率基本維持在一個水平,增大較緩慢。原因可能是:熱浸泡有利于植物細胞溶脹,使細胞壁和細胞膜在后續的微波和超聲波作用下破裂,有利于多糖的溶出,而當浸泡時間6 min以后,延長浸泡時間對后續操作無明顯增效作用,對多糖得率的提升不明顯,即溶脹效果已達到最佳狀態,繼續延長浸泡時間反而增加了操作時間,故浸泡時間以6 min為宜。

圖2 浸泡時間對多糖得率的影響Fig.2 Effects of immersion time on polysaccharide yield

2.1.3 微波功率對多糖得率的影響 由圖3可知,隨著微波功率的增加,多糖得率也逐漸增加,當微波提取功率為200 W時,多糖得率達到最大值,但當微波功率高于200 W之后,多糖得率逐漸下降，故微波功率以200 W為宜。原因可能是:微波的內加熱效應迫使細胞壁和細胞膜破裂,多糖組分迅速離開細胞溶解到水中,當微波功率逐漸增大時,熱效應也不斷增強,多糖得率逐漸上升,微波功率為200 W時,多糖得率達到最大值;但當微波功率繼續增大時,溶出的多糖被過度加熱,部分多糖被分解成小分子糖,在醇沉的時候,部分小分子糖溶解在95%的乙醇溶液中,從而降低了白及多糖得率;且實驗發現當微波功率為300 W時,醇沉物質顏色較暗,原因可能是較高的微波功率產生較多的能量,部分原料糊化,且提取溶液中雜質增多,不利于后期的純化,故微波功率以200 W為宜。

圖3 微波功率對多糖得率的影響Fig.3 Effects of microwave power on polysaccharide rate

2.1.4 提取時間對多糖得率的影響 由圖4可知,隨著提取時間的延長,多糖得率也顯著增加,當微波時間為4 min時,多糖得率達到最大值6.56%,但是當微波時間大于4 min之后,多糖得率逐漸下降。原因可能是隨著提取時間的增加,微波輻射不斷增強,有利于破壞原料的細胞膜和細胞壁,多糖得率迅速增加,但是當提取時間過長時,微波輻射能力越來越強,微波輻射時間過長導致部分多糖水解加大,經醇沉后,粗多糖收率降低,且實驗發現,當提取時間超過6 min后,物料開始糊化。由上述分析可知,提取時間以4 min為宜。

表5 對比實驗結果(n=3)

圖4 提取時間對多糖得率的影響Fig.4 Effects of extration time on polysaccharide yield

2.2 正交實驗設計與結果

根據表1的因素和水平進行正交實驗設計,結果如表3所示。由表3直觀分析可以看出:影響超聲-微波協同提取工藝的順序大小為:浸泡時間(B)>液料比(A)>微波功率(C)>提取時間(D),最優工藝組合為:A2B2C2D3,即液料比20∶1,浸泡時間6 min,微波功率200 W,微波時間5 min。由表4可知,A和B對白及多糖得率有顯著影響(p<0.05),而C和D則無顯著影響(p>0.05)。按最優工藝條件分別進行3次提取實驗,白及多糖的平均得率為6.98%±0.19%,高于正交實驗表中的9個實驗組合,表明實驗方案設計穩定、可行。

表3 正交實驗結果

表4 正交實驗結果方差分析

注:*代表顯著性,即F比>F0.05臨界值。2.3 白及多糖的協同提取作用分析

按表2的工藝參數進行3次平行提取實驗,結果如表5所示。由表5可知,c法的多糖得率顯著高于a法和b法,a法和b法提取的多糖得率僅為c法的46.28%和87.96%。a法與c法對比表明,微波可極大地提高超聲提取效率,b法與c法對比表明,超聲波亦可促進微波提取效率,提高多糖得率,因此超聲-微波協同提取白及多糖高效的原因可能是超聲波和微波2種方法優勢互補、相互協同所產生的結果,從而大大提高了白及多糖的得率,即提高了提取效率,這與劉常金等[12]研究結果一致。

2.4 白及多糖抗氧化活性研究

b法和c法制備的白及多糖對DPPH·具有一定的清除作用,且清除率與濃度呈量效關系,當多糖濃度為0.5 mg/mL時,白及多糖對DPPH·的清除率分別為67.16%和74.21%;在相同濃度下c法制備的白及多糖對DPPH·的清除率較b法高,且均高于Qu Y等[10]的研究結果,原因可能是不同提取方法制備的多糖抗氧化活性存在差異[22]。

圖5 多糖對和DPPH·的清除能力Fig.ability of polysaccharides

3 結論

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Study on ultrasonic-microwave synergistic extraction of polysaccharose fromBletillastriataand its antioxidant activity

CAI Jin-yuan1,2,XIONG Jian-wen1,HUANG Yan-fen2,ZHAO Yao-yin3, ZHANG Cai-yun1,LIU Wei-wei1,WEI Kun-hua2,*

(1.Department of Food and Chemical Engineering,Lushan College of Guangxi University of Science and Technology,Liuzhou 545616,China; 2.Guangxi Key Laboratory of Medicinal Resources Protection and Genetic Improvement, Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plant,Nanning 530023,China; 3.Pingnan SecondaryVocational and Technical School,Pingnan 537300,China)

ultrasonic-microwave synergistic extraction;Bletillastriata;polysaccharide;antioxidant activity

2016-05-06

蔡錦源(1987-)，男，碩士，講師，研究方向：植物有效成分提取純化技術，E-mail:jingyuan025163@163.com。

*通訊作者:韋坤華(1983-)，女，博士，副研究員，研究方向：藥用植物生物技術，E-mail:divinekh@163.com。

國家中醫藥行業科研專項(201507002 );中央財政林木良種苗木培育補貼項目(2015);廣西科學研究與技術開發計劃項目(桂科合14125008-2-21);廣西科學研究與技術開發計劃項目(桂科重14124002-1);南寧市科技局重點研發計劃項目(20163157);廣西高校科學技術研究項目(KY2015YB523)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)22-0274-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.045