自噬在絕經后骨質疏松中作用的研究進展

王偉舟 郭皓 袁勇

1．昆明醫科大學第二附屬醫院，云南 昆明650033

2．昆明醫科大學，云南昆明650599

3．昆明醫科大學第一附屬醫院，云南 昆明650032

骨質疏松癥是一種骨組織骨量減低和微結構退化的全身性骨骼疾病，并伴隨著骨脆性增加及骨折的風險增高［1］。造成骨質疏松的原因復雜而多變，常與年齡、性別、種族、激素水平、飲食及藥物副作用等多方面因素有關［2］。骨質疏松癥常見于絕經后婦女，由于機體卵巢功能減退及雌激素水平下降，直接影響了骨骼細胞的活性并導致骨密度降低［3］。自噬是維持細胞穩態的重要機制，參與調節成骨細胞主導的骨形成與破骨細胞主導的骨吸收的動態平衡，并影響了絕經后骨質疏松(postmenopausal osteoporosis，PMOP)的發生與發展［4］。本文就自噬在PMOP中發揮的作用及其影響作一綜述。

1 PMOP

PMOP臨床上常常伴有身高縮短、脊柱畸形等癥狀，已成為絕經后婦女骨折風險增加，生活質量下降的重要因素［5］。雌激素是體內參與骨代謝調節的激素之一，骨組織細胞表面具有雌激素受體，在絕經后婦女中，雌激素水平下降直接促進了破骨細胞分化，誘導了骨細胞凋亡，并使成骨細胞受到抑制;同時由骨細胞及成骨細胞分泌調節破骨細胞分化的核因子B配體(receptor activator of nuclear factor-B ligand，RANKL)和巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)表達增加、骨保護素(osteoprotegerin，OPG)水平降低，進一步促進了破骨細胞的分化［1］。此外，在PMOP的發病中雌激素還能作為一種抗氧化劑起到防止骨質疏松的作用，而氧化應激是關鍵性起始因子，活性氧(reactive oxygen species，ROS)則可能是其主要根源［6］。當機體在衰老及雌激素水平下降時，體內清除氧自由基的能力下降，進一步導致了ROS的蓄積及線粒體的損傷，并誘導了成骨細胞及骨細胞凋亡，導致骨微結構破壞和骨質疏松的發生［7］。ROS的積累還能增加破骨細胞及其祖細胞中的RANKL和M-CSF并抑制叉頭蛋白O(fork head box O Fox D)的轉錄，進一步刺激了破骨細胞祖細胞的增殖，延長了破骨細胞的壽命，增加了骨吸收并使骨量丟失［8］。

2 自噬與PMOP

2.1 自噬的生物學作用

自噬是一種細胞對構象錯誤的蛋白質和受損的細胞器等進行包裹后，通過與溶酶體結合將其降解并再次循環利用的自我生存機制，對于細胞的存活、分化及維持細胞內環境穩態至關重要［9］。在整個自噬的過程中，自噬相關基因(Atg)及其編碼的蛋白質與自噬調控通路相互構建了復雜的自噬調節網絡并負責細胞的新陳代謝。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是自噬活性調節的關鍵性分子，它能與幾種蛋白質相互作用形成mTORC1復合物及mTORC2復合物［10］。在發生自噬的復雜機制過程中mTORC1能被氨基酸、生長因子、ROS、炎癥和Wnt信號等激活，并在溶酶體降解長壽蛋白和去除受損細胞器的過程中起到負調節作用，而mTORC2主要涉及生長因子信號的傳導［11，12］。

在骨骼的發育過程中，mTOR及信號通路在控制成骨細胞分化過程中均發揮了不同的作用，腺苷酸活化激酶(adenosine monophosphate-actived protein kinase，AMPK)依賴mTOR產生的早期自噬抑制以及AMPK/Akt/mTOR信號途徑介導的晚期mTOR活化都是最佳分化途徑所必需的，mTORC1則在成骨細胞分化晚期通過調節細胞自噬活性促進細胞成熟［13，14］。敲除小鼠成骨細胞自噬相關基因 FIP200(focal adhesion kinase family interacting protein of 200kD)及Atg7后抑制了自噬，造成了細胞自噬障礙、氧化應激水平增高、成骨細胞和骨細胞生成障礙以及骨量減低［15，16］。同時，在成骨細胞分化為骨細胞期間，早期抑制自噬造成了細胞質成分改變及細胞形態成熟障礙并進一步影響了骨細胞網絡結構的生成，造成了骨量減少［17］。此外，自噬相關蛋白WDFY3基因的敲除增加了破骨細胞的分化及其活性，而自噬基因的缺失或組織處于缺氧狀態時將會造成破骨細胞數量和活性增加、體積增大、核增多等一系列變化［18，19］。

2.2 自噬活性調節與PMOP

近幾年研究證實，自噬作為細胞的自我保護機制，能夠減輕氧化應激導致的細胞損傷并維持細胞功能，以延緩或減輕骨量丟失。在PMOP中，隨著年齡的增長和雌激素水平下降，氧化應激造成的ROS蓄積可以損傷細胞膜、線粒體和轉錄因子等細胞成分，并可進一步觸發自噬來清除受損成分使細胞得以存活，但ROS對線粒體的損傷也可能導致細胞積累更多ROS，過度的自噬則可能直接引起細胞凋亡［20，21］。過量蓄積的 ROS 還可以通過 Wnt/βcatenin［22］、RANKL/RANK/OPG［23］、JNK/c-Jun［24］、MAPK和PI3K［25］等信號通路影響核內基因表達，通過抑制成骨細胞譜系增殖和活性、抑制骨祖細胞的成骨分化、刺激破骨細胞前體細胞和破骨細胞的增殖及分化等，最終打破骨吸收和骨形成之間的平衡，引起骨質疏松。

在PMOP中氧化應激能使自噬活性改變并進一步導致骨穩態的失衡，因此一些抗氧化劑通過調節細胞自噬活性顯示出對治療或預防骨質疏松癥具有良好的效果。白藜蘆醇是具有代表性的抗氧化劑之一，在卵巢切除(ovariectomized，OVX)后的大鼠中它能夠觸發自噬并增強成骨細胞分化，通過ROS抑制來減少RANKL誘導的破骨細胞生成以抵抗骨吸收［26］。此外，山奈酚作為一種黃酮醇類抗氧化物在OVX大鼠中也表現出良好的抗骨質疏松效果［27］，它通過激活 Atg5、beclin-1、SQSTM1/p62和 LC3誘導成骨細胞自噬體形成，促進成骨細胞分化及骨礦化，同時抑制破骨細胞的骨吸收［28］。茶多酚不僅能對抗絕經后因雌激素缺乏引起的氧化應激，還具有保護溶酶體膜和穩定溶酶體酶的能力，它通過增加beclin-1和LC3的表達促進自噬，對成骨細胞的分化、存活及骨礦化起到積極作用，并有效抑制破骨細胞的形成和分化［29，30］。除了一些植物性抗氧化劑，研究人員還發現人體自身分泌的褪黑素不僅是一種良好的抗氧化劑，其夜間褪黑激素峰的恢復對圍絕經期婦女骨骼健康也有積極的影響［31］。褪黑素能通過抑制ROS產生，增加 MAPK活性，還能通過ERK通路抑制自噬，提高成骨細胞增殖活性，對于破骨細胞則通過刺激成骨細胞成骨作用減少RANKL的釋放而起到間接調節作用［32］。

3 自噬與骨形成、骨吸收的關系

在骨組織內，成骨細胞主導骨礦化形成，破骨細胞主導骨吸收，骨細胞參與骨形成、骨吸收和傳導信號并啟動骨微結構的修復，這三種細胞類型相輔相成，并在骨形態結構的改造與破壞中共同完成舊骨的吸收和新骨的生成。自噬參與到成骨細胞分化、破骨細胞活性調節及骨細胞的骨改造等方面，并進一步影響到骨形成與骨吸收的平衡。

3.1 自噬與成骨細胞

成骨細胞由骨髓間充質干細胞分化而來，這一過程需要經歷多個階段的轉化，并受到雌激素、細胞因子和基因表達等多方面的調控。轉錄因子FOXO3在間充質干細胞中能誘導細胞的自噬，從而減少成骨細胞分化過程中因線粒體呼吸增加而引起的ROS水平增高，促進成骨細胞分化的順利完成［33］。在分化成熟的成骨細胞中，雌二醇可以直接通過ERs-ERKmTOR通路顯著增強自噬以減少成骨細胞凋亡所造成的骨量丟失［34］。這樣的保護機制可能與減少ROS的產生、刺激谷胱甘肽還原酶的活性以及降低p66shc磷酸化等有關［35］。而雌激素水平下降引起的氧化應激并造成的成骨細胞損傷，可以通過內質網應激激發的早期自噬得以緩解，這可能是成骨細胞對ROS攻擊的保護性反應［36］。Lai等［37］通過過氧化氫誘導成骨細胞自噬水平升高，發現能顯著提高成骨細胞成活率，免于因氧化應激導致的細胞凋亡。此外，雷洛昔芬作為一種選擇性雌激素受體調節劑應用于臨床治療PMOP，它能通過激活AMPK/ULK1通路提高細胞自噬水平、促進成骨細胞分化、增加成骨作用并抑制骨吸收［38，39］。在骨形成的過程中自噬空泡還能作為介質幫助成骨細胞分泌磷灰石晶體至細胞外參與成骨［40］。這說明自噬在維持成骨細胞功能上是一個保護性因素，能起到抗氧化、抗凋亡、參與成骨等功能，對于抗雌激素缺乏性骨質疏松及促進骨形成具有積極作用。

3.2 自噬與破骨細胞

破骨細胞是由骨髓巨細胞分化為前破骨細胞并相互融合而成的高分化多核巨細胞，能在細胞外側形成刷狀緣并通過釋放溶酶體酶和HCl等物質使骨質及膠原降解并形成骨吸收陷窩。目前對于自噬在破骨細胞中的作用尚存在爭議。有研究發現雷帕霉素及其類似物作為經典的自噬誘導劑在OVX大鼠中通過對PFTAIRE1蛋白激酶的上調及減少組織蛋白酶K的含量，能有效抑制破骨細胞的形成和活性并預防骨量丟失約60%［41］。另外鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate，S1P)作為破骨細胞的化學誘導物，能與破骨細胞表面相應受體結合并調節mTOR活性降低自噬［4］。而在一項對絕經后婦女外周循環血S1P的測量中也證實S1P含量增高與骨密度呈現負相關，S1P增強破骨細胞的生成并導致了骨吸收增加［42］。同時，二氫青蒿素能抑制RANKL誘導的NF-κB的活性，增加細胞中ROS的積累并激活自噬程序，使破骨細胞產生受限，進而逆轉 OVX 小鼠的骨丟失［43，44］。由此推測，在 PMOP中破骨細胞自噬水平的增加能抑制其自身的分化及活性，減少骨量丟失。另外的研究則與上述結論相反，在敲除Atg7的OVX小鼠中，研究者們發現自噬的抑制對OVX小鼠的成骨細胞沒有影響，反而能抑制破骨細胞活性并減少骨丟失［45］。同時，在OVX小鼠中Atg5和Atg7基因的缺失使破骨細胞刷狀緣產生受阻，使骨吸收陷窩的深度變淺［46］。而使用雷帕霉素則能逆轉三氧化二鐵介導的破骨細胞自噬低活性狀態，使破骨細胞數量及活性顯著增加［47］。破骨細胞中的自噬相關基因Beclin-1通過RANKL也介導了線粒體產生大量ROS并促進破骨細胞分化成熟［48］。這說明自噬的抑制或缺失使得破骨細胞的溶骨功能受限，提高自噬活性則能改善破骨細胞活性。在對破骨細胞的研究中由于使用不同的動物模型及干預措施的差異，以及破骨細胞來源的特殊性和其活性受到多種因子的調節，自噬在破骨細胞中發揮的作用尚不十分明確，仍需進一步研究。

3.3 自噬與骨細胞

在骨骼發育的過程中一部分成骨細胞經過劇烈的形態轉化后分化成為骨細胞并埋于骨礦化的基質中，之后通過分泌硬骨素及RANKL等來調節成骨細胞和破骨細胞比例并參與到骨重建修復中［49］。骨細胞能通過提高自噬水平幫助其在分化過程中完成細胞形態的改變和細胞器的回收儲能，以適應相對缺氧及營養缺失的狀態，自噬的增加也幫助骨細胞抵御來自骨基質中的氧化應激并保持細胞活力［50］。Yang等［51］在 OVX 大鼠中使用雌激素治療后發現骨細胞在雌激素缺失的狀態下可能因為氧化應激水平的增高導致自噬水平的增加，而恢復雌激素水平則對自噬沒有顯著影響。而更多研究指出抑制骨細胞自噬導致的骨量下降可能更接近于年齡相關的骨質疏松［15，53］。一項研究比較了在骨質疏松的發生過程中性激素及年齡對自噬的影響［52］，發現了骨細胞的自噬水平可能更多受年齡及細胞自身衰老的影響，雌激素對骨細胞的自噬起到了負調節作用。而隨著年齡的增長骨細胞的自噬水平下降、凋亡增加，導致了局部微環境及結構的變化并進一步使骨組織退化。相比成年大鼠，在老年大鼠的骨細胞中一些重要的自噬基因如LC3、Beclin-1和Ulk-1表達出現下降，而與其相應的表現是骨細胞的凋亡和骨密度的下降，自噬增加則對于骨細胞延緩衰老、抗凋亡及抗氧化應激有一定作用［53］。在PMOP中受到氧化應激的影響，骨細胞自噬活性的上調可能作為抗骨質疏松的反應性保護因素，但隨著年齡的增加，骨細胞凋亡開始增多、自噬水平下降，這進一步促進了骨質疏松的發生發展。

4 總結與展望

自噬是細胞生存的重要機制，也在PMOP中發揮著不可替代的作用，但對于目前的研究來說其具體機制尚不是十分清楚。人體中細胞的自噬具有普遍性，而對于PMOP中細胞自噬水平的改變可能不僅僅簡單的涉及到雌激素水平下降和氧化應激，可能還與機體隨著年齡增加伴隨的各器官的逐漸衰老和功能下降有關。在體內衰老的開始一般都能誘導自噬，但自噬的抑制也能促進衰老，這可能是細胞自噬在抵抗逐步積累的有害物達到一定限度并嚴重受損時，促進了細胞的衰老及凋亡［54］。而在成骨細胞和骨細胞中自噬的下降也可能是細胞衰老的標志之一。因此自噬與衰老為將來進一步研究治療PMOP提供了更加清晰的思路與目標。同時，隨著對于自噬在骨質疏松中所發揮作用的不斷深入探索和研究，以及不斷發現的各種激素或藥物對自噬活性產生的影響，或許能通過自噬活性的改變保持骨骼細胞之間的相互平衡并抵御細胞衰老以達到預防和治療骨質疏松癥的目的，從而降低脆性骨折的發生概率并改善絕經后婦女的生活質量。