機械刺激對成骨細胞影響的研究進展

張苗 張玲莉 雷樂 李慧 鄒軍

1. 上海體育學院運動科學學院，上海 200438 2. 上海體育學院發展規劃處，上海 200438

目前，人口老齡化問題日益嚴重，由此引起的骨質疏松的發病率逐年增加，已成為全球性的醫療衛生問題[1]。骨質疏松的發病多由于破骨細胞的骨吸收大于成骨細胞的骨形成而造成的一種骨代謝性疾病[2]。骨形成的過程包括骨吸收和骨形成，其中骨形成主要依靠成骨細胞，成骨細胞(osteoblast, OB)來源于骨髓的間質干細胞(bone mesenchymal stem cells, BMSC)，首先由BMSC定向分化為骨祖細胞，然后分化為成骨細胞前體，最后分化為成骨細胞[3]。成骨細胞在骨形成中經歷成骨細胞的增殖、細胞外基質成熟、細胞外基質礦化和成骨細胞凋亡四個階段[4]。而骨吸收則是依靠破骨細胞(osteoclast, OC)[5]，破骨細胞源于造血源性單核細胞前體細胞融合而成，細胞因子RANKL(receptor activator of nuclear factor-KB ligand)和多肽生長因子CSF-1(M-CSF)誘導分化，經過單核OC的分化、融合為多核OC并活化、生存和附著，發揮骨吸收的功能[6]。骨形成與骨吸收二者共同維持骨骼內動態平衡。

骨骼的動態平衡受到多種因素的影響，其中日常生活中產生的機械刺激是影響骨代謝的重要因素，成骨細胞具有感受器和效應器的作用，進而影響下游的信號轉導過程[7]。由于不同的應力會對成骨細胞的形態、基因的表達等方面產生不同的影響，因此本文從微重力、流體剪切力、壓應力、牽拉力方面具體闡述對成骨細胞的影響。

1 微重力對成骨細胞的影響

微重力是指物體處于失重狀態，與完全失重狀態非常接近，可稱為“零重力”。太空就是一種微重力環境，因此微重力的研究多數為了太空事業的發展。但是由于太空飛行的復雜性，以及樣本量少的原因，常采用人體臥床實驗和動物尾部懸吊實驗來模擬微重力環境，進而來研究微重力環境對于骨量的影響[8]，也用離心裝置來模擬微重力研究對成骨細胞的影響[9]。

張曉鈾等[10]通過回轉器對人的成骨細胞周期變化的研究發現，失重情況下，細胞的增殖數目均低于正常重力組，失重情況下G1期細胞數目顯著增多，而S期與G2+M期數目顯著下降。Yan等[11]實驗證明細胞在模擬微重力48 h細胞增殖減少，且在G2/M 期阻滯，細胞凋亡增加。在相關航天飛行的研究發現，通過對MG-63成骨樣細胞的微重力的培養發現Ⅰ型膠原α1鏈、sBAP和sOC的基因表達水平均降低，表示了微重力對成骨細胞分化的抑制作用[12, 13]。失重或微重力使成骨細胞的生長緩慢，由間質干細胞(mesenchymal stem cells, MSC)分化的成骨細胞數量也相應減少，成骨細胞的細胞骨架的纖維含量下降[14]。王冰等[15]研究表明，成骨肉瘤細胞在拋物線飛行時，細胞的粘附面積降低，細胞的粘附斑識別能力降低；但是當細胞長時處于失重環境時則會粘附功能降低。有研究發現，平均每月太空飛行骨量丟失2%[16,17]，造成的骨量丟失與長期臥床和老年性骨量丟失相同，主要表現在骨形成減少[17-19]。孫怡寧等[20]研究表明，成骨細胞在微重力環境表現出粘附斑數量和面積減少、分布異常、肌動蛋白和微管蛋白細胞骨架的組裝和分布異常。在姜黃的根莖中提取出的天然酚醛樹脂——姜黃素(一種有效的抗氧化劑以及自由基清除劑)，辛茂源通過控制重力、微重力和姜黃素三個實驗條件證實了微重力使成骨細胞的RANKL和骨保護素(osteoprotegerin, OPG)含量、RANKL/OPG比值均明顯升高，維生素D的基因表達水平降低，蛋白表達量減少，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性降低，血漿抗酒石酸酸性磷酸酶(tartratercsistant acid phosphatase, TRAP)活性升高，成骨細胞數目增多，并證實了姜黃素可以減弱微重力對骨形成的抑制作用。蘇嘉霖等[21]在實驗中選取1 d的SD乳鼠的顱骨成骨細胞原代培養，分為正常重力組、微重力組和微重力+降鈣素組，培養72 h后發現，與正常重力組比較，微重力組和微重力+降鈣素組的胰島素樣生長因子1(IGF-1)、OCN、ALP 基因表達均下降，微重力+降鈣素組較微重力組基因表達則增加。

2 流體剪切力對成骨細胞的影響

流體剪切力簡單來說就是將流體看作是一層層在流動，相鄰層之間就會存在摩擦力，那這種流體之間形成的摩擦力可看作流體剪切力。

Reich等[22]認為流體剪切力在骨重建中為重要的中介作用。Sakai等[23]研究發現，生理水平的流體剪切力作用于人成骨肉瘤樣細胞(SaOS-2)，IGF-1活性在3 h后表達量增加3倍，同樣的IGF-β1的蛋白表達在24 h后表達量增加了3倍，生理水平的流體剪切力作用于陽離子通道誘發SaOS-2細胞的TGFβ1 mRNA表達增多，進而促進骨形成。Liegibel等[24]適當的流體剪切力可促進細胞分化的屬性，如ALP活性、纖連蛋白、纖連蛋白受體的表達量增加，成骨細胞的前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)和TGFβ1 基因表達也增加。Cheng等[25]發現，流體剪切力使成骨細胞樣細胞系(MLO-Y4)細胞樹突長度增加，改變成骨細胞形態學特征和縫隙連接蛋白的再分配。同時，流體剪切力會增加成骨細胞的增殖，已有研究表明，ERK5對成骨細胞增殖至關重要[26]，但是流體剪切力通過激活ERK5促進成骨細胞增殖的確切機制了解甚少。Bin等[26]對小鼠胚胎成骨細胞前體細胞(MC3T3-E1)施加流體剪切力1 h或使用ERK5高度抑制劑，結果顯示，1 h的流體剪切力促進成骨細胞增殖，而加入ERK5的高度抑制劑可明顯抵制流體剪切力的作用。Riquelme等[27]將流體剪切力加載于成骨細胞樣細胞系(MLO-Y4)，發現流體剪切力可打開釋放PGE的門戶通道Cx43鏈接蛋白，通過激活ERK進而影響骨代謝。已有實驗表明，流體剪切力可能是通過上調ERK5-AKT-FoxO3a信號通路[26]、Wnt/β -catenin信號通路[28]、PI3K/AKT/mTOR信號通路[29]和 Galphaq -ERK5信號通路[30]的表達，促進成骨細胞的增殖，進而促進骨形成。

3 壓應力對成骨細胞的影響

機體自身重力以及日常活動中負重會對骨骼產生壓力刺激，而這種刺激的普遍性使它一直是研究者研究的重點，尤其是在口腔研究領域。研究者離體條件模擬成骨細胞感受的壓應力，可分為靜力性壓應力和動態性壓應力、單軸和雙軸壓應力等，壓應力的不同對成骨細胞的影響也不同。

Owan[31]和Frost[32]等提出細胞受力大小使用細胞應變量(μstrain)來表示細胞受力值。Frost等[33]實驗發現，應力值1500～3000μstrain可以促進骨重建過程，增加骨量；當小于100～300μstrain時，骨量減少；大于5000μstrain時，則會造成骨骼骨折。李明黎等[34]使用動靜態的壓應力刺激大鼠的骨髓間充質干細胞，檢測表明成骨細胞數量增多，并且動態的作用效果更加明顯，速度更快；靜態壓應力誘導破骨細胞生成的作用更明顯。任可等[35]使新西蘭兔的單側肱骨造成骨折，以天鵝記憶接骨器內固定，在骨折端形成持續的動態壓應力，結果顯示這種持續的動態壓應力上調COX-2、PGE2和cAMP這一信號通路的表達，促使成骨細胞分化成熟，進而促進骨折愈合。曹陽等[36]對人成骨細胞(MG-63)施加單軸牽張應力和壓縮應力，且添加低劑量的細胞松弛素 D后，ERK的磷酸化水平低于基態，與單純壓力組相比差異更加明顯。米曉暉等[37]基于成骨細胞是感受應力刺激的效應器，并轉化為細胞內化學信號的結論，借助其自行開發設計的四點彎曲體外細胞加載裝置進行實驗，對成骨樣細胞株(MG-63)加壓，隨著壓應力的增加，開始成骨細胞表現促進，當超過生理水平，細胞脫落死亡增加。Zhong等[38]對MC3T3-E細胞壓縮和拉伸5 h，細胞生長良好，通過激光掃描共焦顯微鏡觀察到經過5個小時壓縮的細胞，微絲呈現無序排列，細胞形態加厚，變短；壓縮組比核因子k B催化劑配體受體比例明顯降低，Wnt10b和Lrp5基因表達增加較小。曹小波等[39]體外培養SD大鼠髁突軟骨下骨原代成骨細胞，對細胞加壓即刻、6、12、18、24 h后，與對照組比較，觀察細胞的增殖和凋亡情況，發現實驗組的S期細胞百分比增加，凋亡指數在即刻時指數降低，在6 h后指數逐漸恢復，因此適當的壓應力早期能提高成骨細胞的增殖能力并抑制凋亡，促進骨形成。

4 牽拉力對成骨細胞的影響

在運動或日常體力活動時，肌肉會對骨骼產生不同程度的牽拉，骨骼的應力傳導系統對牽拉做出反應。人體內的牽拉刺激可分為動態和靜態牽拉，也可以分為循環與持續的牽拉刺激，體外模擬不同牽拉刺激使成骨細胞產生了不同的反應。

馮雪等[40]體外培養人成骨樣肉瘤細胞Saos-2，對數生長期后對細胞于二維方向上施加牽拉力，牽拉頻率為每分鐘12次，加載強度使細胞平均變形12 %，加載 12 h后，發現細胞變為多角形，貼壁生長狀況良好。曹陽等[36]對人成骨細胞MG-63施加單軸牽張應力和壓縮應力，0.5Hz 4000μstrain 5 min，牽拉力促使成骨細胞骨架中黏附斑復合物形成后，酪氨酸蛋白激酶(protein tyrosine kinase, TPK)活化，使TPK的轉導通路激活。Zhong等[38]對MC3T3-E細胞施加拉伸5 h后，細胞生長良好，微絲導向相互平行，通過激光掃描共焦顯微鏡觀察到經過5 h牽拉的細胞，細胞的形態比空白對照組更薄和更長， 1、3、5 h期間拉伸組Wnt10b和Lrp5基因表達增加，比核因子k B催化劑配體比例增加。Ngan等[41]對牙周成纖維細胞和成骨細胞株(MC3T3-E1)進行拉伸，觀察到這兩種細胞的前列腺素E和白細胞介素-β1表達量增加，成骨細胞數量增加速度較慢。Adachi等[42]體外培養MC3T3-E1，對細胞進行牽拉，使細胞變形，使用玻璃微針觀察到細胞膜的鈣離子通道減少。Arai等[43]循環拉伸MC3T3-E1細胞，觀察到α1 mRNA的表達水平增加3倍。 Neidlinger-Wilke等[44]對成骨樣細胞加載牽拉力和循環壓力，當施加相當于1%壓力的牽拉力時，成骨細胞增殖顯著增加，但堿性磷酸酶和乳酸脫氫酶活性在循環壓力無顯著影響。Ziambaras等[45]對成骨細胞加載牽拉力，同時使用降落傘試驗觀察染料在質膜中擴散的情況，得出循環拉伸增加交界的差距，成骨細胞通過調節細胞的Cx43的胞內定位來完成二者之間的通信。

5 小結

機械刺激在細胞、細胞膜、細胞基質三者構成的結構中傳導，主要依靠細胞骨架實現刺激的傳導，使細胞外信號(機械力)轉導為細胞內信號。成骨細胞可感受體內多種機械刺激，利用體外培養成骨細胞并施加各種機械刺激，并觀察對其的影響。

通過實驗室模擬失重研究太空飛行中飛行員骨礦丟失，流體剪切、壓應力和牽拉力在口腔醫學研究中較集中。其中模擬微重力刺激使骨微細結構改變，骨礦化降低；適當的流體剪切力、壓應力、牽拉力會促進成骨細胞的增殖，調節細胞的周期，改變細胞的形態，上調骨形成的進程，從而增加骨量。一旦刺激強度超過成骨細胞可承受的生理水平，則使細胞凋亡增加，減弱骨形成過程。因此需要嚴格控制刺激的強度、頻率以及加載的時間，觀察細胞的增殖，分化，凋亡，以及基因表達水平的變化。

在體育活動中，成骨細胞感受到各類型的機械刺激，但之前的研究多數集中在機械刺激對成骨細胞的影響，對于破骨細胞的研究則相對較少。現實中機械刺激對機體的影響非常復雜，受到多種因素的影響，因此大部分研究為離體實驗，而在體的實驗則少之又少，沒有通過實驗來證明機械刺激對骨代謝的影響。因此通過分別闡述這幾種機械刺激對成骨細胞的影響，為運動預防和治療骨質疏松和骨折提供更多的理論基礎，也為更加深入的研究運動對成骨細胞的影響的機制提供依據。