豬瘟診斷技術的應用進展

許光勇王朝軍周海深徐利

（1北京養豬育種中心，北京100194；2中國農業大學動物醫學院，北京100193）

豬瘟診斷技術的應用進展

許光勇1,2王朝軍1周海深1徐利1

（1北京養豬育種中心，北京100194；2中國農業大學動物醫學院，北京100193）

豬瘟是一種急性、熱性和高度接觸性傳染病。該病沒有區域性，呈世界性分布，給全球養豬業造成巨大經濟損失。目前豬群感染豬瘟病毒無有效治療措施，完全依靠疫苗接種和加強生物安全體系管理進行預防。雖然中國C株對豬瘟的消滅和防控起到了重要作用，但近年來豬瘟卻表現出復發趨勢，呈現非典型癥狀或隱性感染狀態，故在沒有出現典型癥狀的情況下，如何快速、精準地做出診斷顯得極為重要。文中就數十年來國內外所開發或使用過的豬瘟診斷技術作一綜述。

豬瘟；診斷技術；進展；應用

豬瘟（Classical Sw ine Fever,CSF）是由黃病毒科瘟病毒屬中的豬瘟病毒（Classical Sw ine Fever virus, CSFV）引起豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，俗稱“爛腸瘟”。世界動物衛生組織（OIE）在《國際動物衛生法典》中將其列為必須報告和重要檢疫對象的A類動物疫病，我國農業部將其列為一類動物疫病[1,2]。豬瘟病毒可感染各個階段豬群，分別可導致母豬群出現流產、產死胎和木乃伊胎及弱仔比例升高，公豬群呈現精液帶毒，產房哺乳仔豬出現腹瀉、發病死亡率升高，以及中大豬群出現以發熱、全身如針尖點狀出血、腸管糜爛或脾梗死等癥狀為主要特征[3]的發病。豬瘟對全球養豬業來講可謂是毀滅性打擊。當前，感染豬瘟病毒后治療基本無效，對豬瘟防控主要是采取預防措施，即疫苗免疫配合生物安全的綜合管理措施。目前大部分使用的豬瘟活疫苗為豬瘟兔化弱毒株（C株）疫苗，經細胞擴大培養后制成細胞苗接種使用，也有部分是將毒株接種動物采集組織制成脾淋苗后使用，以及其他一些核酸疫苗、基因缺失疫苗及DNA疫苗等[4]。鄭慶端等于2005年報道，在接種C株豬瘟活疫苗4天后即可部分產生免疫力。在養豬實際生產中，接種豬瘟活疫苗2～3周后，約80%的豬群能夠產生有效保護抗體。近年來在中國，豬瘟雖不呈現暴發形勢，但仍有零散發生，呈現溫和感染狀態，對豬場尤其是種豬場造成隱性危害。在歐洲、南美洲等地區呈現復發趨勢，且一些宣布已經消滅豬瘟的國家再次出現豬瘟復發的報道[4]。因此，對豬瘟病毒是否感染及豬瘟病毒的診斷工作應做出更高、更精準的要求和標準，故多種豬瘟診斷方法孕育而生。

豬瘟自1833年在美國俄亥俄州發現以來，在全球范圍內流行傳播[5]。但隨著養豬業的發展，豬瘟診斷技術越來越多，重復性和可靠性也越來越高，由數十年前的流行病學調查統計、臨床表現和病理解剖變化的主觀判斷，到如今常用的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法、免疫熒光試驗、實時定量PCR或基因芯片檢測等實驗室檢測技術，無疑對豬瘟病毒感染確診起到促進作用。

1 豬瘟病原與流行特征

豬瘟病毒是單股正鏈RNA病毒，病毒粒子直徑約40～50 nm，呈球形，核衣殼為二十面體對稱，基因組全長12.3 kb，有一個大的開放閱讀框并能編碼含3 898個氨基酸的多聚蛋白，該蛋白在宿主細胞和病毒自身蛋白酶作用下，產生4個結構蛋白（C、Erns、E1和E2）和8個非結構蛋白（Np ro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B），而E2蛋白即能誘導產生豬瘟保護性抗體[4,6]。

在我國，首次發現豬瘟的時間是1925年。1954年，我國老一輩科學家成功研制出豬瘟兔化弱毒疫苗，該毒株一直延續使用至今并取得良好的免疫效果，世界上其他一些國家借助于該毒株疫苗成功完成豬瘟凈化與根除工作，而中國于1956年就提出消滅豬瘟計劃，至今已60年時間，豬瘟仍存在于全國范圍內的養殖場，故我們還有很長一段路要走，尤其是把精準確診作為前提[7]。

豬瘟一年四季均可發生，對各個階段、品種、性別的豬群均易感，無地方流行性，一般可通過水平和垂直傳播，也可以通過蚊蟲等媒介傳播，豬瘟病毒對堿性消毒藥如苛性鈉或生石灰等敏感。隨著時間推移，豬瘟病毒為適應環境生存而不斷發生新的變化，故其所表現的臨床反應也越來越復雜。

2 臨床癥狀

豬感染豬瘟病毒后，其潛伏期一般為5～7天，根據養殖環境差異、區域性病毒流行性、豬群健康度以及綜合管理水平等條件不同，其表現出的病程長短不一，臨床癥狀會有所差異，通?？蓪⑵浞譃樽罴毙孕?、急性型、亞急性型、慢性型、溫和型和繁殖障礙型[8]。受到豬瘟病毒感染，可能會出現體溫升高呈稽留熱、全身性出血（點）或妊娠母豬流產及所產死胎、木乃伊胎和弱仔數量增加等臨床表現。

突然發病并迅速死亡的多為最急性型豬瘟。急性型豬瘟通?？梢婓w溫升高至41～42℃、食欲不振、扎堆嗜睡、結膜炎、皮膚黏膜廣泛充血出血。亞急性型與急性型豬瘟癥狀非常相似，但其病程稍長，通常在一些老疫情區或管理不到位的豬場發生。慢性型豬瘟主要表現為被毛粗亂、精神萎靡、漸進性消瘦、體溫忽高忽低、便秘與腹瀉交替，病程可持續三個月以上，死亡率在10%～30%之間。溫和型豬瘟是目前最流行的一種，感染后可能不出現任何臨床癥狀，但豬群尤其是種豬群長期帶毒和排毒，通過水平和垂直傳播方式導致豬瘟病毒在本場內循環感染。繁殖障礙型豬瘟往往呈現出混合感染情況，例如與圓環病毒、藍耳病病毒等共同存在，導致母豬流產或早產、產死胎木乃伊胎和弱仔數量增加。無論是何種類型豬瘟，若通過臨床癥狀表現來進行判斷，應該眼觀看到高燒稽留和出血性素質，二者往往缺一不可。

3 病理解剖變化

根據豬瘟病毒毒力強弱和機體自身免疫狀態，感染豬瘟病毒后其表現的病理變化各不相同。最急性型偶爾在黏膜漿膜、腎臟、心臟包膜或外膜以及膀胱黏膜表面見到少量細小的點狀出血，淋巴結輕微腫脹。病理變化最明顯的應該是急性型，具有典型的敗血癥變化，可見皮膚全身性出血，全身淋巴結腫脹、深紅色、切開呈紅白相間的大理石樣外觀，脾臟邊緣出現出血性梗死，腎臟實質性變性，經常出現麻雀腎，切開腎臟可見髓質和皮質均有點狀或線狀出血，消化道有出血點或出血斑，嚴重者可見形成潰瘍灶，肝臟變性質脆，呼吸系統和心血管均可見出血斑點[9]。其他類型豬瘟無特別典型病理變化，需結合其他信息或實驗室檢測結果進行判斷。

4 實驗室診斷技術

豬瘟診斷技術較多，既可以鑒定病原又可以檢測抗體，方法包括實驗室常見的免疫熒光試驗（FAT）、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、瓊脂擴散試驗（AGP）和間接血凝試驗（IHA）等方法，分子生物學檢測技術包括反轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）、巢式PCR、多重引物PCR、環介導等溫擴增技術（RT-LAMP）等，另外還有一些基因芯片檢測技術和核酸探針技術用于豬瘟病毒診斷工作[6,10]。

4.1 常規診斷技術

4.1.1 免疫熒光試驗

免疫熒光試驗（FAT）是檢測豬瘟的常用方法，其原理是將抗豬瘟病毒抗體IgG提純并標記熒光物，做成熒光試劑并用于扁桃體或淋巴結等病料的觸片或冰凍切片進行著色或染色，然后借助于熒光顯微鏡觀察，在顯微鏡下若能看到綠色熒光，表明豬瘟病毒抗體染色為陽性結果。FAT可有效提高早期感染豬瘟病毒檢出率，對強毒株和弱毒株均有較高的準確性，且使用范圍廣，在某些大型規?；i場比較適用，對于豬瘟防控起到極其重要的意義。FAT與其他方法相比，具備診斷所需時間短、檢出率高、準確性強的優點[11]。

FAT包括組織直接免疫熒光試驗、細胞培養直接免疫熒光試驗和間接免疫熒光試驗。組織直接FAT主要是利用所采集的組織或臟器，用石蠟包埋或冰凍切片進行固定，再用豬瘟特異性熒光抗體進行染色并在熒光顯微鏡下觀察，若出現亮綠色熒光即表明有豬瘟病毒存在。細胞培養直接FAT主要是將可疑病料勻漿制成上清液接種于PK-15細胞進行增殖培養，加入酶標抗體染色，然后肉眼觀察即可。間接FAT直接在可疑組織上滴加抗豬瘟陽性血清（1∶4）作用30分鐘，洗滌后加入羊抗豬IgG熒光抗體作用30分鐘，漂洗干燥后于熒光顯微鏡下觀察結果[12]。何若鋼等2008年利用免疫熒光試驗技術對廣西十幾個豬場進行豬瘟調查，結果表明外表看似健康且無任何臨床癥狀的豬群豬瘟抗原陽性率高達7.21%。自1965年Robertson報道以來，FAT是國內外最常用的方法之一，該方法直觀、可靠，廣泛應用于組織病料的豬瘟病毒檢測，適用于早期感染和無明顯臨床癥狀的帶毒豬排查。

4.1.2 酶聯免疫吸附試驗

酶聯免疫吸附試驗（ELISA）是世界動物衛生組織推薦的血清抗體檢測方法，具有一定敏感性和特異性，可用于豬群抗體監測和抗原檢測，目前也是規?；B殖場普遍采用的一種檢測技術。ELISA法是利用抗原抗體發生反應的原理，包括間接ELISA、競爭ELISA、抗原捕獲ELISA、Dot-ELISA和微波快速ELISA，各種方法均有優缺點[8]。周宗安、楊曉梅和Leforban、丘惠深以及Hergarten等通過大量試驗證明ELISA法的敏感性和特異性。由于具備高敏感性和特異性、試劑穩定無放射性和可操作性強等特點，該方法成為很多豬場和實驗室常用的血清學檢測方法。

4.1.3 間接血凝試驗

間接血凝試驗（IHA）的原理為將抗原或抗體包被于紅細胞表面作為載體，然后與相應的抗體或抗原結合，發生紅細胞凝集反應，其包括正向和反向IHA。正向IHA用于檢測血清中豬瘟抗體，反向IHA用于檢測組織病料中豬瘟抗原。

4.1.4 瓊脂擴散試驗

瓊脂擴散試驗（AGP）是利用可溶性抗原與抗體在瓊脂凝膠內擴散形成白色沉淀的原理，包括單向和雙向AGP。該方法簡單，但特異性和敏感性較差，通常不采用。

4.1.5 免疫膠體金技術

免疫膠體金技術具有靈敏度高和操作簡單等優點，發展和應用前景十分廣闊。陳龍賓等在2007年建立了豬瘟膠體金免疫層析快速診斷方法。

4.2 分子生物學檢測技術

隨著分子生物學技術的發展，其在豬瘟檢測上的應用越來越多。利用分子生物學技術檢測豬瘟病原主要是PCR，不同類型PCR都是針對豬瘟病毒進行診斷。RT-PCR利用特異性引物將豬瘟病毒核酸進行反轉錄，經PCR一系列反應擴增，然后將擴增產物進行凝膠電泳和染色，從而判定是否存在病毒感染。巢式PCR使用2對引物進行擴增即二次擴增，然后進行觀察判定。多重PCR是應用多對引物同時擴增，對引物設計要求較高。RT-LAMP是新建的一種恒溫核酸擴增技術，針對靶基因6個區域設計4對特異引物，在等溫條件下完成擴增反應[13]。實時熒光定量PCR（Real-Time PCR）和前面4種有所區別，前4種是從定性方面進行判斷，而Real-Time PCR是從定量的角度進行判斷。

不同類型PCR優缺點各異，現簡單闡述如下：RT-PCR操作簡單、靈敏度和特異性高、重復性好，對豬瘟病毒識別性很強，檢測范圍廣泛，在臨床診斷中發揮著重要作用。巢式PCR利用2對引物，其擴增特異性和靈敏度得到進一步提高。多重PCR是采用2對或更多引物擴增，但對引物設計要求更高。環介導等溫核酸擴增技術無需借助儀器即可觀察結果，為基層和現場檢測提供便利，故具有良好的推廣應用前景[6,11]。Real-Time PCR能夠解決普通PCR假陽性問題，分析感染病毒數量，無需電泳操作，但由于該技術受到PCR等儀器要求較高、所用試劑成本較高等因素制約，故沒有在基層推廣開[14]。曾小娜等2009年分別采用RT-PCR和RT-LAMP法對80份可疑樣品進行豬瘟病率分別為36.25%和38.75%。Chen等2009年同樣用RT-PCR和RT-LAMP法對可疑樣本檢測豬瘟病毒，檢出陽性率分別為78%和89%。RT-LAMP法的敏感性較普通RT-PCR高。Le等[15]通過4 710份樣品證實Real-Time PCR方法敏感、特異、快速和高通量。Das等[16]采用Real-Time PCR對早期感染豬瘟病毒的血液樣品檢測，具有極高的靈敏度。Hoffmann等[17]將建立的檢測豬瘟病毒的Real-Time PCR技術與商業化試劑盒比較，在臨床應用中顯示出良好的靈敏性和特異性。

4.3 基因芯片檢測技術

生物芯片技術是根據分子間特異性相互作用的原理，將生命科學領域中不連續的分析過程集成于芯片表面的微型生物化學分析系統，對細胞、蛋白和基因等進行快速準確地檢測。若細分的話，可分為基因芯片、蛋白質芯片、細胞芯片和組織芯片，其中基因芯片是近年來的研究熱點。楊林[18]2005年通過基因測序，對分離的豬瘟野毒毒株進行鑒定，并對E2基因進行序列分析，在與傳統的石門毒株和疫苗毒株比較后，發現分離到的豬瘟野毒與疫苗毒存在一定差異，且E2基因部分序列接近Alfort，但與Brescia同源性最低。雖然基因芯片檢測技術優點較多，但處于探索階段，高成本等制約因素仍是該技術大面積推廣亟需解決的難題。

5 動物回歸試驗

動物回歸試驗是最經典和可靠的方法。通常是采集有豬瘟典型病變的組織，經過碾磨、破碎、離心等處理后提取病毒，一方面可進行豬瘟病毒分離鑒定，另一方面可以將病毒感染健康（SPF）豬，然后觀察有無豬瘟臨床癥狀。該方法處理過程比較復雜，耗時較長，且回歸本體動物只能在小范圍內試驗，以避免病原傳播的風險，不利于疾病防控。

6 其他相關診斷技術

隨著科技不斷進步，分子生物學技術占據了半壁江山，在豬瘟診斷技術方面還包含一些不常用方法，例如家兔交互免疫試驗、金標卡診斷技術、核酸探針技術等。這些診斷技術或是處于開發探索階段，或是不適合科學技術進步的步伐而被淘汰。

7 展望

我國雖是養豬大國，但不是養豬強國。隨著養豬業迅速發展，養豬技術也不斷得到提高，但豬病卻越來越多、越來越復雜。借助于中國C株豬瘟疫苗，歐美一些發達國家已經將豬瘟徹底消滅。在中國，嚴重困擾養豬業的豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、偽狂犬病、口蹄疫和豬流行性腹瀉等仍將長期存在，如何有效控制甚至消滅這些傳染病，是我們獸醫工作者今后的工作重點。目前在我國，豬瘟雖沒有大面積暴發，但在全國范圍內仍呈零散溫和發生，且容易導致基層獸醫人員誤診，因此，準確診斷是控制和凈化豬瘟的基礎工作和重要前提。目前，部分經驗豐富的豬場專職獸醫技術人員可通過豬場疾病背景、生產數據分析、流行動態、臨床癥狀和病理變化等現場資料進行初步診斷，如需確診還是要借助于實驗室診斷技術。豬瘟診斷最常用的實驗室方法包括ELISA和RT-PCR法。美國IDEXX公司有商品化ELISA抗體和抗原檢測試劑盒，但ELISA法容易出現假陽性，準確性和特異性均有待提高；RT-PCR法準確度高，但需要采集臟器等組織樣品，對于活體豬只來說采集扁桃體操作困難，且對豬只應激大。如何制定一種操作便捷、特異性強、靈敏度高、可重復性好、適合中國養豬業使用的診斷技術是我們不斷追求的目標。

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S854.43；S858.28

A

1673-4645(2017)05-0060-05

2016-11-02

北京三元種業科技股份有限公司自立課題（SYZYZ20150005）

許光勇，男，江西金溪人，在讀博士研究生，獸醫師，國家執業獸醫師，主要從事規模化豬場生產管理與豬病防控研究，E-m ail：vetbbsc@163.com