外陰疾病中RhoA的表達及意義

崔丹丹 武昕

外陰疾病中RhoA的表達及意義

崔丹丹 武昕

目的探討外陰疾病中RhoA的表達情況,分析其與外陰疾病發生發展的關系。方法采用免疫組化方法檢測RhoA在外陰硬化性苔蘚及外陰鱗狀細胞癌中的表達,并收集外陰鱗狀細胞癌患者的臨床病理資料進行分析。結果RhoA在外陰硬化性苔蘚中的表達為(44.07±1.45),顯著高于其在外陰正常皮膚中的表達(31.22±2.46)(P＜0.05)。在外陰鱗狀細胞癌中的表達為(77.22±3.08),顯著高于其在外陰硬化性苔蘚與外陰正常皮膚中的表達(P＜0.05)。RhoA在Ⅰ～Ⅱ期外陰磷狀細胞癌中表達為(71.83±4.31),Ⅲ～Ⅳ期為(82.05±1.32),比較差異具有統計學意義(P＜0.05)；在不同病理分級中表達為：高分化(71.22±2.89),中低分化(75.05±2.78),比較差異無統計學意義(P＞0.05)；在有淋巴結轉移中為(78.21±1.71),明顯高于無淋巴結轉移的(63.31±2.51)(P＜0.05)；RhoA的表達與年齡及細胞分化無關。結論RhoA的表達與外陰磷狀細胞癌及外陰硬化性苔癬的發生、發展有關。

RhoA；外陰鱗狀細胞癌；外陰硬化性苔蘚；免疫組化

Rho家族蛋白是小G蛋白家族中的成員之一,其具有三磷酸鳥苷(GTP)酶活性,Rho家族蛋白在基因轉錄、細胞周期調控、膜泡運輸中起重要作用。文獻顯示,RhoA在人類多種惡性腫瘤中異常表達,如食管癌、胃癌、宮頸癌等,并在其發生發展和侵襲轉移中發揮重要作用［1-3］。

外陰硬化性苔癬(vulvar lichen sclerosus,VLS)是常見的外陰上皮非內瘤樣病變,可發生于任何年齡,以40歲左右的婦女多見,是一種潛在的癌前病變。其中約有4%～7%患有外陰硬化性苔蘚的婦女發展為外陰癌［4］。外陰鱗狀上皮癌占外陰惡性腫瘤的80%以上,約60%左右患者合并有外陰硬化性苔蘚［5］。目前兩種疾病的病因及發病機制尚未完全弄清,并且外陰硬化性苔蘚在什么情況下會進展為外陰磷狀細胞癌尚不清楚。因此本研究運用免疫組化的方法探討RhoA的表達與外陰硬化性苔癬和外陰磷狀細胞癌發生、發展是否相關。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2007～20012年中國醫科大學附屬第一醫院病理教研室經手術切除或活檢存檔的蠟塊；其中外陰磷狀細胞癌60例,外陰硬化性苔蘚30例,外陰正常皮膚20例。所有患者病理資料完整,術前均未行放化療及物理治療,標本均經2位資深病理醫師鏡下確認。收集外陰鱗狀細胞癌患者的詳細臨床病理資料,年齡33～72歲,平均年齡(50.1±7.3)歲。根據國際婦產科聯盟(FIGO)(2009年)臨床分期：Ⅰ期16例,Ⅱ期30例,Ⅲ期10例,Ⅳ期4例；分化程度：高分化者36例,中分化者14例,低分化者10例。有淋巴結轉移者16例,無淋巴結轉移24例。

1.2 實驗試劑 兔抗人RhoA多克隆抗體、即用型SABC試劑盒,二氨基聯苯胺(DAB)顯色液均購自北京博奧森生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化方法檢測 石蠟切片進行常規脫蠟水化。并置于3%過氧化氫(H2O2)室溫孵育20 min從而滅活內源性過氧化物酶,再進行抗原修復,滴加5%BSA封閉液,室溫20 min,滴加適當一抗RhoA(1:200)于4℃冰箱過夜,再滴加相對應的二抗生物素化山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)孵育30 min,滴加鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物工作液,并在室溫下孵育20 min,隨后進行DAB顯色,最后蘇木素復染封片。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照片。

1.3.2 結果判定 在光學顯微鏡下觀察,以細胞漿或細胞膜出現黃色或棕黃色顆粒者則認定為陽性,運用BX60萬能顯微照相系統(OLYMPUS,日本)對切片進行圖像采集,利用顯微圖像分析系統對采集的圖像進行積分光密度值測定,每張切片分別選取5個不同視野,計算同一張切片的平均積分光密度值,則代表陽性染色細胞在該組織中的表達水平。

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0統計學軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數± 標準差(±s)表示,采用t檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 RhoA在外陰正常皮膚組織、外陰硬化性苔蘚及外陰磷狀細胞癌中的表達 RhoA蛋白陽性表達于細胞漿及細胞膜,呈棕黃色顆粒。在外陰正常皮膚中陽性細胞分布于基底細胞層,表達陽性細胞的平均光密度值為(31.22±2.46)；在外陰硬化性苔癬中陽性細胞位于表皮中上層,在真皮細胞中不表達,表達陽性細胞的平均光密度值為(44.07±1.45),外陰正常皮膚與外陰硬化性苔癬表達陽性細胞的平均光密度值比較差異具有統計學意義(P＜0.05)。RhoA在外陰鱗狀細胞癌中表達陽性細胞分布在癌巢中,表達陽性細胞的平均光密度值為(77.22±3.08),顯著高于其在外陰硬化性苔癬與外陰正常皮膚中的表達,差異具有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 RhoA的表達與外陰鱗狀細胞癌臨床病理特征的關系RhoA在Ⅰ～Ⅱ期外陰磷狀細胞癌中表達為(71.83±4.31),Ⅲ～Ⅳ期為(82.05±1.32),比較差異具有統計學意義(P＜0.05)；在不同病理分級中表達為：高分化(71.22±2.89),中低分化(75.05±2.78),比較差異無統計學意義(P＞0.05)；在有淋巴結轉移中為(78.21±1.71),明顯高于無淋巴結轉移的(63.31±2.51),差異具有統計學意義(P＜0.05)；RhoA的表達與年齡無關(P＞0.05)。

3 討論

Rho(ras homologous) 家族蛋白是Ras 超家族中小分子量G蛋白的成員之一,包括有RhoA、B、C、D和E等蛋白。RhoA全稱為Ras同源類似物A,其基因全長約16 kb,定位于3p21.3。RhoA含有高度保守的二磷酸鳥苷(GDP)/GTP結合區和GTP酶活性區,當與GDP結合時處于非活性狀態,而與GTP結合時則處于活性狀態,此外還具有靶區和膜定位結構。同異三聚體G蛋白一樣,通過無活性GDP狀態和活性GTP狀態方式的轉換發揮其重要的分子開關作用。本研究結果證實RhoA在外陰硬化性苔蘚中的表達顯著高于外陰正常組織,提示RhoA參與外陰硬化性苔蘚病變的發生,其可能通過調節細胞凋亡及細胞分裂等生物學行為參與外陰硬化性苔蘚病變的發生,具體機制則有待進一步研究探討。

本研究顯示RhoA在外陰磷狀細胞癌中的表達顯著高于外陰正常皮膚,并且在有淋巴結轉移及臨床分期高的病例中高表達。據文獻報道［6-8］,處于活性狀態的RhoA可促進腫瘤的侵襲與轉移,其機制可能為:①調控下游效應蛋白ROCK或mDia,調節細胞肌動蛋白微絲骨架的聚合、導致肌動蛋白微絲的重排,加強細胞遷移能力;②使細胞周期素D1(Cyclin D1)的表達上調、抑制p21WAF1和p27KIPl的表達,將細胞阻滯于G1和G2/M期,從而影響腫瘤細胞的增殖、生長;③使上皮型鈣粘素(E-cadherin)表達下調,破壞腫瘤細胞間粘附;④調節基質金屬蛋白酶-2(MMP2)、基質金屬蛋白酶-9(MMP9)的活性從而促進細胞外基質降解;⑤調節血管內皮生長因子(VEGF)、環氧合 酶-2(COX-2)促進新生血管生成;基因轉錄激活激活蛋白-1(AP-1)、核因子κB(NF-κB)、血清反應因子(SRF)等核轉錄因子,這些核轉錄因子可使腫瘤相關基因發生轉錄。另外,RhoA在外陰磷狀細胞癌中的表達顯著高于外陰硬化性苔蘚(P＜0.05)。這與其惡性轉化的能力相關。RhoA具有癌基因的功能,它可引起胸腺細胞的錨定非依賴性生長并可導致胸腺細胞在裸鼠體內形成腫瘤,提示RhoA具有對胸腺細胞的惡性轉化能力。RhoA還通過降低轉錄因子甲狀腺轉錄因子 1(TTF 1)的活性介導了Ras對胸腺細胞的惡性轉化,抑制RhoA的功能表達可逆轉這一轉化作用。

［1］張雷.食管癌中RhoA蛋白的表達及意義.海南醫學院學報,2015,21(4):460-463.

［2］Su XJ,Tang ZF,Li Q,et al.Expression and significance of RhoA and NF-κB in human gastric carcinoma.Zhonghua zhong liu za zhi,2011,33(4):276-279.

［3］Liu X,Chen D,Liu G.Overexpression of RhoA promotes the proliferation and migration of cervical cancer cells.Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,2014,78(11):1895-1901.

［4］Hp VDN,Ia VDA,de Hullu JA.Review of squamous premalignant vulvar lesions.Critical Reviews in Oncology/hematology,2008,68(2):131-156.

［5］Rolfe KJ,Maclean AB,Crow JC,et al.TP53 mutations in vulval lichen sclerosus adjacent to squamous cell carcinoma of the vulva.British Journal of Cancer,2003,89(12):2249-2253.

［6］張麗華,王婧,武昕.Moesin和RhoA蛋白在外陰鱗癌中的表達及意義.中國婦幼保健,2015,30(3):414-416.

［7］張德宇,張士泰,歐陽玲.RhoA蛋白在外陰鱗癌組織中的表達及臨床意義.中國醫科大學學報,2012,41(10):937-940.

［8］崔丹丹.RhoA和RhoC蛋白在外陰硬化性苔蘚及外陰鱗癌中表達及意義.中國醫科大學,2011.

Expression and significance of RhoA in vulvar disease

CUI Dan-dan,WU Xin.Shenyang City Maternal and Infantile Hospital,Shenyang 110000,China

ObjectiveTo investigate expression of RhoA in vulvar disease,and to analyze its relationship with occurrence and development of vulvar disease.MethodsImmunohistochemistry method was applied to detected expression of RhoA in lichen sclerosus of vulva and vulvar squamous cell carcinoma.Clinical and pathological data of vulvar squamous cell carcinoma patients were collected for analysis.ResultsExpression of RhoA in lichen sclerosus of vulva was obviously higher as(44.07±1.45) than(31.22±2.46) in normal vulvar skin(P＜0.05).Expression of RhoA in vulvar squamous cell carcinoma was much higher as(77.22±3.08) than those in lichen sclerosus of vulva and normal vulvar skin(P＜0.05).Expression of RhoA was(71.83±4.31) in stage Ⅰ～Ⅱvulvar squamous cell carcinoma and(82.05±1.32) in stage Ⅲ～Ⅳ,and the difference had statistical significance(P＜0.05).Expression in different pathological classification was(71.22±2.89) in high differentiation and(75.05±2.78) in low differentiation.There was no statistically significant difference between high differentiation and low differentiation(P＞0.05).Expression in lymphatic metastasis was obviously higher as(78.21±1.71) than(63.31±2.51) in non-lymphatic metastasis(P＜0.05).Expression of RhoA was not ralted with age and cell differentiation.ConclusionExpression of RhoA is related with occurrence and development of vulvar squamous cell carcinoma and lichen sclerosus of vulva.

RhoA; Vulvar squamous cell carcinoma; Lichen sclerosus of vulva; Immunohistochemistry

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.01.027

2016-12-09］

110000 沈陽市婦嬰醫院(崔丹丹)；中國醫科大學附屬第一醫院婦科(武昕)

武昕