瞬時受體電位6型通道在重大中樞神經系統疾病中病理生理機制及其作為藥物靶點的前景

屈忠偉，張 慧，王以政（軍事醫學研究院軍事認知與腦科學研究所，北京 100850）

腦卒中、阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）和癲癇等神經系統疾病不僅嚴重影響患者的健康，而且造成極大的社會負擔。在中國，腦卒中已成為致殘率第一、致死率第二的疾病，每年用于該疾病的治療費用＞100億；目前AD患者人數已＞800萬，預測2040年患病人數或將達到2600萬。癲癇因其致殘率高、病程長等特點亦嚴重損害患者生理及心理健康，對患者及家庭造成嚴重負擔。流行病學調查顯示，我國癲癇患病率為0.4%～0.7%，由此推算目前在我國有600萬～900萬癲癇患者。臨床上70%～80%患者在服用抗癲癇藥物后癥狀得到控制，但仍有20%～25%的患者癥狀控制不理想，稱為難治性癲癇［1］。因此，重大腦疾病的防治在中國的腦研究計劃中占有重要組成部分。近年來大量研究發現，離子通道在神經系統疾病的發生發展中扮演重要角色，逐漸成為開發防治神經系統疾病的重要藥物靶點。

瞬時受體電位（transient receptor potential，TRP）通道最早在果蠅中被發現并克隆出來［2-3］。目前被發現的TRP家族成員已＞30種［4］，而根據序列同源性，這些成員又被分為7個亞家族：TRPC(TRP canonical），TRPV（TRP vanilloid），TRPM（TRP melastatin），TRPML（TRP muco-lipin），TRPN（TRP NOMP-C），TRPA（TRP ankyrin）和 TRPP（TRP polycystic）家族［5］。TRP亞基為六次跨膜蛋白，它們以同源或異源四聚體形式組成可通透Ca2+，Mg2+和Na+等離子的非選擇性陽離子通道。TRP通道在哺乳動物體內廣泛分布，尤其是神經系統。越來越多的研究表明，TRPC家族成員，尤其是TRPC6參與了許多中樞神經系統（central nervous system，CNS）疾病的發生發展過程。本文將簡述近年來TRPC6在CNS中的生理功能及其在疾病狀態下的病理改變，總結其作為藥物靶點治療疾病的前景。

1 TRPC6的激活方式及其在中樞神經系統中的生理功能

TRPC家族包括7個成員，根據序列同源性，又可分為3個亞家族，包括TRPC1/4/5，TRPC2和TRPC3/6/7［6］。其中 TRPC6亞基含有6個跨膜結構域（S1～S6），在S5和S6之間形成孔區，以同源或異源四聚體形式組成非選擇性陽離子通道。該通道可通過多種形式被激活：①TRPC6通道可被磷脂酶C（phospholipase C，PLC）催化產生的甘油二酯（diacylglycerol，DAG）或其類似物1-油酰基-2-乙酰基-sn-丙三醇（1-oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol，OAG）直接激活［7-9］；② Src家族成員Fyn也可使TRPC6磷酸化而使其活化［10］；③ TRPC6通道活性也受到細胞內外鈣離子濃度的調節［11］，當細胞外鈣離子濃度在0.1～1 mmol·L-1或細胞內鈣離子在濃度20～200 nmol·L-1時，TRPC6通道活性上調；而當胞內外鈣離子濃度進一步升高時，TRPC6通道活性受到抑制；④TRPC6通道也可被一些天然化合物激活，如貫葉金絲桃素（hyperforin）［12］。

TRPC6在神經系統有著廣泛的表達，7～14 d齡大鼠的海馬組織中表達量達到峰值［13］，提示TRPC6在神經元的發育階段發揮著重要的作用。近年研究發現，TRPC6參與諸多神經發育的生理過程。

首先，TRPC6參與神經元生長錐的導向［14］。腦內神經網絡的建立是大腦執行功能的前提。因此，神經元軸突如何精確地投射到下游功能核團和靶細胞一直是神經科學領域的研究重點。研究表明，TRPC3和TRPC6介導的鈣離子內流參與了腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）誘導的小腦顆粒細胞軸突生長錐的導向。在此過程中，阻斷TRPC通道活性，或敲低TRPC3和TRPC6表達后，均能有效地阻斷BDNF誘導的軸突生長錐導向。

其次，TRPC6促進小腦顆粒細胞的存活［15］。體外培養的小腦顆粒細胞在血清剝奪條件下大量死亡，而外源性給予BDNF后細胞死亡明顯減少。進一步研究發現，這種保護作用是通過誘導TRPC3和TRPC6通道的開放、進鈣并激活環磷酸腺苷反應元件結合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）信號通路實現的。在體敲除TRPC3或TRPC6，會導致小腦顆粒細胞的大量死亡。

第三，TRPC6參與樹突的生長和樹突棘形成［13，16］。樹突正常的生長發育和樹突棘的形成是神經元之間建立突觸聯系、傳遞信號及神經網絡建立中重要的環節。而樹突發育異常則會影響智力發育或導致疾病的發生，如唐氏綜合征［17］和X染色體易裂癥［18］等。研究發現，大鼠海馬神經元中TRPC6蛋白表達的高峰期與樹突最大生長期重合。體內外實驗均證明，TRPC6過表達可增加鈣調蛋白激酶Ⅳ（calmodulin-dependent kinaseⅣ，CaMKⅣ）和CREB的磷酸化水平及樹突生長［13］。同時體外實驗發現，TRPC6表達被敲低后，樹突生長受到抑制。進一步研究發現，在培養的大鼠海馬神經元中，敲低TRPC6表達，樹突棘的數目明顯減少［13］。而在TRPC6轉基因小鼠體內，海馬神經元的樹突棘數量明顯增加，并且小鼠的空間學習和記憶能力明顯增強［13］。

綜上所述，TRPC6的穩定表達和激活在神經元的存活、樹突的生長發育及神經網絡的建立過程中都發揮著重要的作用。

2 TRPC6在中樞神經系統疾病中的病理改變

正常范圍內的鈣離子濃度可調節神經元的多種功能，如神經元興奮性和突觸可塑性等，而鈣離子濃度異常則可能導致神經元死亡［19-20］。作為Ca2+通道，TRPC6在神經系統發育階段發揮著重要的生理功能。此外，大量研究表明，TRPC6的表達異常參與許多神經系統疾病的病理過程［21-22］。如在缺血性腦卒中，TRPC6表達下降；在AD病人腦組織中，TRPC6表達同樣下調；而癲癇病人皮質中TRPC6表達上升。

2.1 TRPC6在缺血性腦卒中表達的變化

缺血性腦卒中具有高致殘率、高致死率和高復發率的特點。雖然大量研究表明，N-甲基-D-天冬氨酸（N-Methyl-D-aspartic acid receptor,NMDA）受體介導的大量鈣離子內流是造成缺血性腦卒中過程中神經元損傷的主要原因，但以NMDA受體為靶點開發的藥物因同時抑制了其正常生理功能，進而產生嚴重的副作用，臨床試驗結果并不理想［23-24］。在此基礎上，研究者提出通過激活或維持神經元自身的促存活信號通路作為對抗神經元損傷的新策略。

杜婉璐等［25］研究發現，在大鼠大腦中動脈局灶缺血模型中，半暗帶區TRPC6蛋白被NMDA受體介導激活的蛋白水解酶卡配因（calpain）切割，進而發生降解，同時CREB信號通路被抑制。而無論是直接抑制卡配因的激活還是通過設計的小肽阻斷卡配因對TRPC6的切割，都可減少TRPC6的降解并維持CREB信號通路的激活，進而減少缺血誘導的神經元損傷，并且顯著提高模型大鼠術后的行為學評分和存活率。在隨后的進一步研究中發現，TRPC6對神經元的保護功能是通過抑制NMDA受體的活性實現的［26］。此外，也有研究發現，在缺血發生后，側腦室立即給予TRPC6激動劑貫葉金絲桃素同樣可減少TRPC6降解并激活CREB信號通路，減少腦組織梗死面積［27］。另外，TRPC6表達上調在大鼠視網膜缺血模型中同樣對視神經節細胞起到保護作用［28］。相反的是，Chen等［29］研究發現，在小鼠腦皮質區缺血后，TRPC6的表達增加誘導的Na+內流激活了NMDA受體，造成胞內鈣超載和神經元損傷。而敲除TRPC6則可減少缺血誘導的神經元死亡。雖然，目前造成這些差異的原因尚不明確，但可肯定的是，在缺血性腦卒中過程中，維持TRPC6蛋白的穩定表達及正常生理功能可抑制缺血誘導的NMDA受體過度活化、減少鈣離子內流，維持神經元內鈣離子穩態，進而減少缺血造成的神經元損傷。

2.2 TRPC6在阿爾茨海默病中表達的變化

β淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）的大量產生被認為與AD發生相關。Aβ由β分泌酶和γ分泌酶切割淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）產生，而α分泌酶切割APP則產生神經營養因子可溶性APPα（soluble APPα，sAPPα）［30］。γ分泌酶除切割底物APP外，還包括Notch和鈣黏蛋白（cadherin）等等［31］。因此，以抑制γ分泌酶活性為靶點開發的藥物，會引起包括認知障礙和免疫系統異常等一系列嚴重的副作用［32］。能特異性地抑制γ分泌酶對APP的切割而不影響γ分泌酶對其他底物的作用成為當前AD藥物開發的一個難點。

關于鈣通道與胞內鈣離子濃度對Aβ形成的研究已有大量報道。如有研究發現，突觸上NMDA受體的激活可誘導α分泌酶切割APP，從而減少Aβ的形成［33］。TRPC6作為鈣離子通道，具有促進神經元樹突的生長和樹突棘的形成及促神經元存活，并增強小鼠空間學習和記憶能力［13，15-16］。此外也有研究發現，γ分泌酶的重要組成成分早老素2（presenilin 2）影響TRPC6介導的鈣離子內流入HEK293細胞［34］。提示TRPC6可能參與了AD的病理過程。王軍峰等［35］在體外研究中發現，TRPC6蛋白與APP結合后阻斷了γ分泌酶對APP切割位點的識別，從而以不依賴自身通道活性的方式，特異性地減少了Aβ的產生，同時不影響γ分泌酶對其他底物的切割。隨后他們鑒定出TRPC6蛋白487-508位氨基酸序列阻斷了γ分泌酶對APP的切割，并合成了帶有穿膜肽序列及該段序列的融合肽段。在APP/PS1轉基因的AD模型小鼠體內注射該肽段，在不影響γ分泌酶對Notch等底物切割的條件下，可有效減少Aβ的產生和老年斑的形成，并顯著提高小鼠的空間學習和記憶能力。在隨后的大樣本、多中心臨床研究中發現，與無認知功能障礙的對照組相比，輕度認知障礙患者及不同臨床分期的AD患者血液中TRPC6的mRNA水平均明顯降低。對AD患者死后的額葉和顳葉組織進行免疫組織化學檢測發現，TRPC6表達明顯減少［36］。這些結果提示，外周血液中TRPC6的mRNA水平可作為AD早期臨床診斷的生物標志物，并通過ROC曲線分析發現，檢測血液中TRPC6的mRNA水平與檢測腦脊液中Aβ42具有相似的診斷精確性。

2.3 TRPC6在癲癇中表達的變化

癲癇是一種以癇性發作為主要特征的神經系統疾病，其神經病理基礎為神經元異常興奮和大腦神經元異常同步放電。病因包括腦損傷、腦卒中、顱內腫瘤和顱內感染等。癲癇發作可導致皮質、杏仁核及海馬區神經元死亡，并伴有海馬硬化（hippocampal sclerosis，HS）、苔蘚纖維出芽（mossy fiber sprouting，MFS）和突觸重建等腦結構和功能的變化。已有大量研究表明，鈣離子通道參與癲癇的發病過程，例如L型鈣通道的抑制劑尼卡地平（nicardipine）無論在體內還是在體外的癲癇模型中都可有效阻斷MFS。TRPC6作為鈣離子通道，一方面，在海馬區，尤其是齒狀回，具有豐富的表達［37］；另一方面，又具有參與神經元軸突生長錐導向、促進樹突生長和樹突棘形成的能力。提示TRPC6可能參與了癲癇的病理過程。

目前，關于TRPC6在癲癇的病理過程中的功能尚無統一的結論，主要觀點有2種：①TRPC6可能參與了癲癇形成過程。Zeng等［38］研究發現，在匹羅卡品（pilocarpine）誘導的持續癲癇模型小鼠的海馬CA3區，TRPC3和TRPC6的表達都有明顯的升高。在此過程中通過抗體中和TRPC3可減少MFS，而用抗體中和TRPC6則可減少CA3區錐體神經元的樹突分支數量和樹突棘的數目。此外，在患有難治性癲癇患者的腦皮質樣本中，同樣發現TRPC3和TRPC6的表達明顯升高。這些結果提示，TRPC3可能參與了匹羅卡品誘導的MFS，TRPC6參與了突觸重建的過程。Zheng等［39］研究發現，構成頑固性癲癇重要病因之一的局灶皮質發育不良癥（focal cortical dysplasia，FCD）患者皮質組織中TRPC6，BDNF和CaMKⅣ表達明顯增加。上述結果提示，TRPC6可能參與了癲癇的形成過程。②TRPC6抑制神經元對癲癇刺激的敏感性。Kim等［40］發現，在匹羅卡品誘導的癲癇模型大鼠海馬CA1、CA3和齒狀回TRPC6的表達水平是降低的，并參與了癲癇誘導的神經元死亡。進一步研究發現，TRPC6的穩定表達可降低神經元對驚厥刺激的敏感性及對抗神經元損傷。

綜上，TRPC6很可能同時參與癲癇的形成過程及癲癇誘導的神經元死亡過程。但其具體機制仍不明確，可能的原因為海馬區不同的細胞亞群參與了癲癇誘導的不同的病理過程［41］，但有待進一步的研究。

3 TRPC6作為藥物靶點的研究現狀

離子通道具有調節膜電位、影響基因表達等能力，參與機體許多重要生理功能，如信號傳導、肌肉伸縮、感覺傳導、血壓調節和細胞增殖等。而離子通道的表達或活性異常則會誘發多種系統疾病，如循環系統和神經系統等。因此，將離子通道作為藥物開發靶點治療疾病存在巨大潛力。

TRPC6參與許多CNS疾病的病理過程。特異性地控制TRPC6的表達調節，有可能減少或減緩疾病的發生發展。雖然，目前關于TRPC6異常病理變化的機制還不明確，但可以總結得出主要有以下2種方式：①通過影響通道活性，介導下游信號通路的激活；②通過其自身蛋白表達量變化影響相關酶與底物的結合。基于上述2種假說，TRPC6作為藥物靶點進行藥物開發可從以下3個方面探索。

第一，篩選、開發TRPC6特異性的激動劑和抑制劑。研究表明，可通過調節TRPC6離子通道活性對疾病進行干預，但目前尚無TRPC6特異性的激動劑和抑制劑。研究較明確且廣泛應用的TRPC6非特異性激動劑僅有貫葉金絲桃素［42］。在貫葉金絲桃素對上述3種疾病的研究報道中，多數報道認為，其對于缺血性卒中具有保護作用，但也有研究得到相反結論。因此，對于貫葉金絲桃素治療缺血性卒中仍有待進一步探究。對于AD而言，貫葉金絲桃素能夠減少Aβ的沉積及其誘發的神經毒性，從而減輕認知損傷。目前對于貫葉金絲桃素治療癲癇的研究同樣存在爭議，但因研究較少尚無定論。研究發現，貫葉金絲桃素除激活TRPC6外，還具有質子載體的性質，可誘導線粒體釋放鋅離子和鈣離子等［43-44］。另外，也有一些研究人員試圖從化合物庫中篩選TRPC6特異性的激動劑。Sawamura等人從8000個化合物中篩選得到了兩個TRPC6的激動劑PPZ1和PPZ2，而且這兩個化合物具有促進神經元樹突生長和促進神經元存活的能力［45］。雖然實驗結果顯示這兩個化合物還可以激活TRPC3和TRPC7，但為進一步的開發提供了方向。

第二，以TRPC6為靶點開發肽類藥物。多肽類藥物在臨床上已早有應用，從胰島素到谷胱甘肽，再至催產素和內啡肽等。在大鼠局灶腦缺血模型中，使用設計合成的小肽阻斷卡配因對TRPC6的切割可有效保護缺血誘導的腦損傷。同樣，在AD小鼠模型中，通過小肽阻斷γ分泌酶對APP的作用同樣可減少Aβ的產生，提高小鼠的空間學習記憶能力。這些結果提示，肽類藥物在神經系統疾病中同樣可發揮良好的效果。當然，除了制備困難、抗原性及易降解等缺點，神經系統肽類藥物的開發還面臨著給藥方式、血腦屏障通透性等問題，需要在進一步的研究中解決。

第三，以調控TRPC6表達的信號通路為靶點開發藥物。TRPC6在神經元中的穩定表達對維持神經系統的生理功能至關重要。研究發現，TRPC6在神經元中的表達受到興奮性神經遞質谷氨酸的調控［46］。一方面，谷氨酸可通過NMDA受體1型亞基（NMDA receptor subunit 1,NR1）和2A型亞基（NR2A）組成的離子通道（NR1/NR2A）鈣神經素信號通路誘導TRPC6轉錄和翻譯增加；另一方面，谷氨酸又可通過NR1和2B型亞基（NR2B）組成的離子通道（NR1/NR2B）激活卡配因介導TRPC6的降解。因此可以針對調控TRPC6表達的信號通路開發藥物，從而影響TRPC6在神經元中的表達，進而達到治療目的。但目前研究尚少，潛在風險仍待進一步評估。

4 展望

綜上，TRPC6在正常生理狀態下具有促進神經元軸突生長錐導向、樹突生長和興奮性突觸形成等功能。同時大量研究表明，TRPC6的病理生理學改變在缺血性腦卒中、AD和癲癇等CNS疾病中亦發揮著重要作用。研究表明，干預TRPC6的表達及通道活性可影響缺血造成的神經元死亡、Aβ產生及癲癇形成過程，有望成為治療神經系統疾病新靶點。雖然，新一步闡明TRPC6在相關神經系統疾病中的病理機制、增加藥物特異性和減少藥物副作用等問題還有待深入研究，但是，從篩選、開發TRPC6特異性激動劑和抑制劑、以TRPC6為靶點開發肽類藥物及以調控TRPC6表達的信號通路這3個方面探索藥物開發存在巨大潛力。

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