蜜蜂體表攜帶花粉種類、數(shù)量和活力評(píng)估的研究方法

陳新蘭 董 坤

（1 云南省蜜蜂資源可持續(xù)利用工程研究中心 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方蜜蜂研究所 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，昆明 650201；2 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201）

在自然界中，大約85%的顯花植物依賴?yán)ハx授粉，其中蜜蜂是最理想的授粉昆蟲。據(jù)1899年Knutr記載，在植物上采集到的800多種傳粉昆蟲中，膜翅目就占了43.7%，且蜜蜂總科占其總數(shù)55.7%[1]。此外，我國(guó)吳燕如教授曾調(diào)查了獼猴桃花期中傳粉昆蟲的種類，共鑒定的16種傳粉昆蟲中，蜜蜂占68.75%[2]。由此可見(jiàn)，蜜蜂在植物授粉中占據(jù)著重要的地位。

蜜蜂授粉不僅可以增加農(nóng)作物的產(chǎn)量、改善果實(shí)和種子的品種以及提高后代的生活力，還有利于生態(tài)環(huán)境的改善[3]。本課題組在開(kāi)展中蜂為騰沖紅花油茶授粉效果研究中發(fā)現(xiàn)，中蜂自由式授粉可以顯著提高騰沖紅花油茶的坐果率及結(jié)籽率[4]；此外，在研究蜜蜂為石榴授粉中發(fā)現(xiàn)，蜜蜂授粉可以提高石榴的坐果率及果實(shí)品質(zhì)[5]。國(guó)內(nèi)外專家的大量研究均表明蜜蜂授粉對(duì)農(nóng)作物和果樹(shù)等的增產(chǎn)是不可估量的。

蜜蜂的授粉性能可以從三個(gè)方面考慮：測(cè)定蜜蜂訪花后的坐果率或結(jié)籽率；測(cè)定蜜蜂體表攜帶的花粉種類、數(shù)量以及柱頭上有效的花粉落置數(shù)量；測(cè)定蜜蜂授粉后植物的繁殖成功率，即生殖效率[6]。蜜蜂體表攜帶花粉的種類數(shù)量及柱頭上有效的花粉落置量，在一定程度上影響著授粉成功與否。由于繁殖成功不僅依賴于傳粉昆蟲傳播的花粉數(shù)量，也依賴于其他因素，比如：花粉和雌蕊的相互作用、雌花的選擇，所以在評(píng)估蜜蜂的授粉性能時(shí)，主要對(duì)前兩個(gè)方面進(jìn)行觀察[7]。本文主要介紹了國(guó)內(nèi)外針對(duì)蜜蜂體表攜帶花粉種類鑒定、花粉粒計(jì)數(shù)及花粉活力測(cè)定等方面的研究方法，并比較了各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，以期為其他同仁開(kāi)展此類研究提供一些有益的幫助。

1 花粉種類鑒定方法

鑒定蜜蜂體表攜帶的花粉種類，首先需從蜜蜂體表淋洗花粉粒。可通過(guò)沖洗或渦旋蜜蜂身體使其身上的花粉粒淋洗下，然后通過(guò)離心方法使花粉粒沉淀，得到的花粉粒用于進(jìn)一步的分析。為了研究授粉效率，蜜蜂后足花粉筐里的花粉團(tuán)在淋洗蜜蜂前應(yīng)該去掉，因?yàn)榛ǚ蹐F(tuán)通常對(duì)授粉沒(méi)有太大作用。如果對(duì)蜜蜂的采集行為觀察非常細(xì)致，也可只從蜜蜂身體接觸了柱頭的部位上取下花粉進(jìn)行分析鑒定[8]。

蜜蜂身上攜帶的來(lái)自不同植物的花粉，通常可以依靠診斷其性狀來(lái)區(qū)分，比如：花粉粒的大小、花粉外壁紋飾、花粉孔和花粉溝的數(shù)量及大小等[9]。光學(xué)顯微鏡是最早用于觀察研究花粉的工具，至今已有300多年的歷史，且一直沿用至今。到了20世紀(jì)60年代，掃描電子顯微鏡開(kāi)始用于觀察花粉，其所得圖片不僅立體感強(qiáng)、清晰逼真，且能揭示很多光學(xué)顯微鏡所無(wú)法揭示的信息，近幾十年已在花粉形態(tài)研究中廣為應(yīng)用[10]。目前有研究人員也開(kāi)始嘗試通過(guò)分子生物學(xué)方法鑒定花粉種類。

1.1 光學(xué)顯微鏡的鑒定方法

這是鑒定花粉運(yùn)用最廣的一種方法。在花粉鑒定前，花粉要經(jīng)過(guò)醋酸水解及染色，醋酸水解溶液包括冰醋酸和濃硫酸（9:1），其水解及染色過(guò)程為[7]：

（1）加入花粉樣本于冰醋酸溶液中10 min，然后進(jìn)行離心，棄去上清液；

（2）加入少量摩爾的醋酸水解混合液（冰醋酸:濃硫酸=9:1）；

（3）在水浴中將溶液緩緩加熱到沸點(diǎn)，并用玻璃棒不停的攪拌；

（4）將溶液冷卻幾分鐘，進(jìn)行離心，然后棄去上清液；

（5）重新懸浮在蒸餾水中，進(jìn)行離心，然后輕輕倒出上清液，重復(fù)這個(gè)步驟；

（6）用甲基綠或醋酸洋紅進(jìn)行染色，以便更好觀察。

醋酸水解及染色之后，花粉可以保存，并制成永久裝片，常用方法是用甘油膠封片。其過(guò)程如下[7]：

（1）準(zhǔn)備少量的甘油明膠，通常由10 g 明膠、30 ml 甘油和35 ml 蒸餾水混合而成；

（2）在干凈的顯微鏡載玻片上加一滴準(zhǔn)備好的甘油明膠、花粉樣本和染色劑；

（3）緩緩地對(duì)裝片加熱，攪動(dòng)使其徹底地均勻混合；

（4）蓋上蓋玻片，在邊緣四周用指甲油或其他清漆封住即可。

利用光學(xué)顯微鏡觀測(cè)上述染色后的花粉或花粉永久玻片，通過(guò)花粉的外部形態(tài)和大小即可鑒定花粉的種類。該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，科研人員可自己操作觀測(cè)，成本低，省時(shí)省力，對(duì)形態(tài)結(jié)構(gòu)差異大的花粉易鑒定，但是對(duì)于差異小的花粉，很難對(duì)其進(jìn)行鑒定[11]。

1.2 掃描電子顯微鏡的鑒定方法

掃描電子顯微鏡也是鑒定花粉很普遍的方法，其一般過(guò)程是取花粉樣本，用導(dǎo)電膠將其固定樣品臺(tái)上，噴金，選用適當(dāng)電壓，然后進(jìn)行觀察[12]。用此方法可觀測(cè)到花粉外壁表面的紋飾、花粉孔及花粉溝的數(shù)量和大小，易鑒定差異小的花粉，但其成本高。由于掃描電子顯微鏡價(jià)格昂貴，通常有專門固定人員操作使用，科研人員一般只需送樣、等待電鏡圖片結(jié)果。

1.3 分子生物學(xué)的鑒定方法

鑒定花粉種類還可以用分子生物學(xué)的方法。如果蜜蜂只攜帶同一個(gè)種的植物花粉粒，那這很簡(jiǎn)單，因?yàn)榇罅康幕ǚ劭梢院喜ⅲ瑥亩梢砸黄鹛崛NA。但是如果蜜蜂攜帶著不同種植物的混合花粉，分析混合花粉就變得很難。在這種情況下，可以用單一花粉基因型策略，即對(duì)單一花粉粒的基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增[13]。相對(duì)于光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡，此方法能更精準(zhǔn)的確定花粉種類，但操作復(fù)雜，耗時(shí)耗力。

2 花粉數(shù)量觀測(cè)計(jì)數(shù)方法

2.1 血球計(jì)數(shù)板的觀測(cè)方法

這是花粉粒計(jì)數(shù)最常用的方法。血球計(jì)數(shù)板最初主要用于血細(xì)胞計(jì)數(shù)，但它也可以用于計(jì)算一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)體積的花粉粒溶液中的花粉粒數(shù)量[7]。首先，將從蜜蜂身上收集的花粉制成花粉懸液，然后在血球計(jì)數(shù)板上滴一滴一定體積的花粉懸液，再放于顯微鏡下觀察，數(shù)出這滴懸液中花粉粒的數(shù)量，就能計(jì)算整個(gè)懸液中花粉粒的總量[14]。具體操作步驟如下：

（1） 從蜜蜂身上收集花粉；

（2） 使花粉粒懸浮在已知體積的70%乙醇溶液中，進(jìn)行渦旋以確保混合均勻；

（3）用移液管取一定量的花粉粒懸液于血球計(jì)上；

（4）在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。血球計(jì)廠商規(guī)定了在觀察視野下的已知體積懸液，并提供簡(jiǎn)單的用法說(shuō)明（在初始懸液中，可以從目標(biāo)計(jì)數(shù)推回到絕對(duì)計(jì)數(shù)）；

（5）當(dāng)花粉粒的數(shù)量很少時(shí)，要測(cè)量的懸液可以滴在帶有刻度的顯微鏡載玻片上，然后數(shù)出所有的花粉粒。

2.2 其他方法

除了運(yùn)用血球計(jì)數(shù)板對(duì)花粉進(jìn)行計(jì)數(shù)外，還可使用成本更高的方法，如：電子粒子計(jì)數(shù)或基于激光的計(jì)數(shù)器。此外，也可使用立體顯微鏡直接對(duì)蜜蜂身上的花粉粒進(jìn)行計(jì)數(shù)，但誤差相對(duì)更大。

3 花粉活力的測(cè)定方法

3.1 熒光反應(yīng)法（FCR）

這種方法主要用于測(cè)定花粉萌發(fā)前的花粉活力，此方法是基于二乙酸熒光素（FDA）的熒光反應(yīng)。FDA是一種可透過(guò)細(xì)胞膜并作為熒光素積蓄在活細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)，因此有活力的花粉一般都能在顯微鏡下發(fā)出熒光[15]。

3.2 氯化三苯基四氮唑法（TTC法）

根據(jù)有活力的花粉粒在呼吸過(guò)程中產(chǎn)生氧化還原反應(yīng)，無(wú)活力的花粉粒無(wú)此反應(yīng)的原理,當(dāng)氯化三苯基四氮唑（TTC）滲入有活力的花粉粒內(nèi)，并作為氫受體被脫輔酶上的氫還原時(shí)，便由無(wú)色的TTC變?yōu)榧t色的三苯基甲唑（TTF），這種方法適用于經(jīng)干燥等加工處理后的新鮮花粉，對(duì)陳舊不新鮮的花粉不適用。具體方法步驟是：從蜜蜂身上取少量花粉放于載玻片上，加0.5%的TTC溶液1～2滴，然后蓋上蓋玻片，放于35℃左右的恒溫箱中15 min，最后用顯微鏡進(jìn)行觀察，有活力的花粉染成深紅色，敗育花粉染成綠色[16]。

3.3 過(guò)氧化物酶測(cè)定法

有活力的花粉含有活躍的過(guò)氧化物酶，此酶能利用過(guò)氧化氫使各種多酚及芳香族胺發(fā)生氧化而產(chǎn)生顏色，依據(jù)顏色可知花粉的活性強(qiáng)弱。具體方法步驟是：首先將0.5%聯(lián)苯胺、0.5% α-萘酚和0.25%碳酸鈉混合均勻，然后滴1滴于載玻片上，再滴1滴0.3%過(guò)氧化氫，然后放入少量花粉，攪勻，蓋上蓋玻片，于30℃環(huán)境下放置30 min左右，最后在顯微鏡下觀察，有活力的花粉呈現(xiàn)紅色[17]。

3.4 碘-碘化鉀法（I-KI）

此法常用于鑒定含淀粉質(zhì)類花粉，染成藍(lán)紫色的為發(fā)育好、活力強(qiáng)的花粉，呈黃褐色的為發(fā)育不良的花粉。具體方法步驟是：取少量花粉放于載玻片上，先加1滴蒸餾水，再加2滴碘-碘化鉀溶液（將2 g碘化鉀溶于10 ml蒸餾水中，再加入1 g碘，用玻璃棒攪拌至全部溶解，最后加蒸餾水定容到300 ml），蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察，被染成藍(lán)色的即為有活力的花粉[17]。

3.5 蔗糖溶液培養(yǎng)基培養(yǎng)法

蔗糖培養(yǎng)基由10%蔗糖、100 mg/kg硼酸和5 mg/kg赤霉素配制而成，其中，蔗糖的作用是維持花粉與培養(yǎng)基之間的滲透平衡，以及提供花粉萌發(fā)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量來(lái)源，不同植物花粉的萌發(fā)所需要的蔗糖濃度不同；硼酸的作用是促進(jìn)糖的吸收和代謝，同時(shí)增加氧的吸收，這有利于花粉的萌發(fā)，不同植物花粉萌發(fā)所需要的硼濃度也有所不同。具體方法步驟是：將新鮮花粉直接放于蔗糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，12 h后，在顯微鏡下觀察，如果花粉管有明顯的伸長(zhǎng)（花粉管的長(zhǎng)度至少是花粉粒直徑的2倍），則為有活力的花粉[18]。

熒光反應(yīng)通常是測(cè)定花粉營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞質(zhì)膜的完整性和細(xì)胞質(zhì)非特異性酯酶的活性，操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)明顯，容易觀察，但是二乙酸熒光素具有一定的毒性；TTC法、過(guò)氧化物酶法和I-KI法都是染色法，在染色過(guò)程中存在比較大的誤差性，但是省時(shí)省力，成本低；蔗糖溶液培養(yǎng)基法實(shí)用，簡(jiǎn)單，可直接觀察花粉管的發(fā)育情況，準(zhǔn)確性高，但耗時(shí)。

不同植物花粉的特性不同，所需要的適宜染色條件也不同[19]。TTC染色法常用于測(cè)定花粉活力的強(qiáng)弱，它的染色效果和花粉中的脫氫酶有一定的關(guān)系，王艷哲等[20]在研究測(cè)定玉米花粉活力發(fā)現(xiàn)，TTC能準(zhǔn)確、快速的測(cè)定玉米花粉活力，但是有報(bào)道TTC法測(cè)定黎豆、辣椒等花粉活力時(shí)，效果不明顯或不能染色。I-KI染色法適宜測(cè)定淀粉質(zhì)類花粉，即對(duì)禾本科類植物的花粉進(jìn)行染色時(shí)，效果明顯。俞奔馳等[21]發(fā)現(xiàn)用I-KI法能準(zhǔn)確的測(cè)定木薯花粉的活力，但是TTC法和培養(yǎng)基法效果不理想。蔗糖溶液培養(yǎng)基培養(yǎng)法適用廣，效果明顯，對(duì)大多數(shù)植物的花粉活力測(cè)定有顯著的效果。但需要注意的是，不同植物的花粉萌發(fā)所需的蔗糖、硼酸和赤霉素比例不同。綜上所述，不同的測(cè)定方法，對(duì)植物花粉的測(cè)定效果各不同，因此，應(yīng)結(jié)合花粉特性、染色效果、染色時(shí)間及試劑比例等條件來(lái)選擇一種合適的花粉測(cè)定方法。

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