核磁共振氫譜與化學計量學相結合鑒別麥盧卡蜂蜜

核磁共振氫譜與化學計量學相結合鑒別麥盧卡蜂蜜

近年來，麥盧卡（Manuka）蜂蜜由于其優越的抑菌活性和特殊的口味在國際蜂蜜市場上獨樹一幟。麥盧卡樹是一種只生長在新西蘭和澳大利亞部分地區的灌木，而麥盧卡蜂蜜主要產自新西蘭。據估算，目前全世界銷售的麥盧卡蜂蜜是新西蘭真實產量的3倍以上。由此可見，麥盧卡蜂蜜造假現象已非常嚴重。因此，迫切需要一種可靠的檢測體系來對麥盧卡蜂蜜進行質量控制。而目前在世界范圍內已獲得廣泛認可的蜂蜜摻假檢測技術是碳同位素方法檢測碳4植物糖。很顯然，這種方法并不適合麥盧卡蜂蜜的真偽鑒別。為此，法國學者Spiteri M.和新西蘭學者Rogers K.等合作，采用核磁共振氫譜（1H NMR）與化學計量學相結合的方法，對264個來自新西蘭和澳大利亞的蜂蜜樣品進行分析研究，利用核磁共振氫譜鑒定了麥盧卡蜂蜜的核磁共振新標識物-獨麥素（Leptosperin），并對Leptosperin、甲基乙二醛（MGO）和二羥基丙酮（DHA）進行量化，建立偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）模型來鑒別麥盧卡蜂蜜，取得良好的效果，其正確率達89%。

DHA和MGO作為麥盧卡蜂蜜的標識性物質，其中DHA在成熟和貯藏過程中不斷地轉變為MGO，MGO則是麥盧卡蜂蜜強抑菌活性的主要因素。之前也有學者從成分角度去鑒別麥盧卡蜂蜜和其他蜂蜜的研究，但方法較為復雜，往往需要結合多個技術同時進行。Spiteri M.等利用獨立成分分析（ICA）確定蜂蜜樣品的鑒別信號：在2.30 ppm和1.38 ppm處分別出現兩個MGO的獨立信號峰，在4.41 ppm處出現一個DHA信號源。驗證發現，麥盧卡蜂蜜確實含有較高的MGO和DHA，但非麥盧卡蜂蜜中也含有部分的DHA和MGO，這可能是由于蜜蜂采集多種花蜜導致蜂蜜不純所致。由于MGO和DHA可以人為添加，因此需要尋找其他信號來提升準確度。研究發現，在芳香區7.42 ppm處發現的單峰與MGO和DHA相關性很高。將這個特征峰與3,4,5-三甲氧基苯甲酸和丁香酸甲酯這兩種物質的峰進行對比，結果發現它們并不匹配。猜測此峰也許是2012年就被Kato等人報道過的麥盧卡蜂蜜特征標志物Leptosperin的變形峰。于是，他們利用核磁共振氫譜分析Leptosperin后，在7.34 ppm處發現一個單峰，但與之前不同的是，此時溶解蜂蜜的溶劑是甲醇而不是水。驗證發現，圖譜的化學位移的確與溶劑有關。隨后，他們通過核磁共振量化Leptosperin，發現與2014年Kato等人通過超高液相色譜（UPLC）獲得的值保持高度一致；利用液相色譜和飛行時間質譜聯用（LC-TOF）找到與Leptosperin對應的化合物；進一步將通過核磁共振氫譜進行量化的DHA和MGO值與高效液相色譜（HPLC）值比較，發現它們的相關系數分別高達0.99和0.98，表明核磁共振可準確量化這三種關鍵成分。

他們利用核磁共振氫譜對84種麥盧卡單花蜜和183種其他類型單花蜜的三種關鍵成分進行量化，結果發現，麥盧卡蜂蜜的DHA均值為1154 mg/kg，95%范圍為50～2515 mg/kg；非麥盧卡蜂蜜的DHA均值為347 mg/kg，95%范圍為0～1332 mg/kg。麥盧卡蜂蜜的MGO均值為672 mg/kg，95%范圍為18～1555 mg/kg；非麥盧卡蜂蜜的MGO均值為233mg/kg，95%范圍為0～940 mg/kg。麥盧卡蜂蜜的Leptosperin均值為784 mg/kg，95%范圍為62～1556 mg/kg；非麥盧卡蜂蜜的Leptosperin均值為394 mg/kg，95%范圍為0～980 mg/kg。雖然麥盧卡蜂蜜與非麥盧卡蜂蜜均值和范圍存在明顯差異，但依然有一些重疊部分，這可能是蜂蜜純度不夠造成的。因此，在模型建立之前，剔除100個卡努卡（Kanuka）、卡馬希（Kamahi）和麥盧卡混合蜜的樣品值以及45個離群值，一共122個樣品參與建模。從中隨機選擇104個蜂蜜樣品（85%）作為訓練集，18個樣品（15%）作為檢測集，用于模型驗證，從而建立一個PLSDA模型，用以鑒別麥盧卡蜂蜜和其他蜂蜜。

該研究利用核磁共振氫譜技術發現了麥盧卡蜂蜜新的核磁共振標識物Leptosperin，是一項重大的突破。而且，該研究的樣本量較大且均通過多種方法進行驗證，較好的重現性和特征性表明，核磁共振氫譜方法具有較高的可行性和可靠性。利用這種方法鑒定和量化麥盧卡蜂蜜的三個特征性標識物，不僅快速高效而且成本較低；再者，該技術既可明確鑒別是否存在麥盧卡蜂蜜，也可鑒別麥盧卡純蜜和混合蜜，這有助于解決新西蘭蜂蜜和澳大利亞蜂蜜混合摻假問題。同時，這一方法值得我們在其他蜂蜜質量控制研究中加以借鑒。

浙江大學動物科學學院思娟娟胡福良編譯