2016年國內外蜂產品質量安全研究進展

周金慧 張文文 王欣然 張金振 金玥 楊樹鵬 趙文 陳蘭珍 問亞琴王鵬 黃京平 劉婷婷 李熠

（中國農業科學院蜜蜂研究所農業部蜂產品質量監督檢驗測試中心，北京100093）

2016年國內外蜂產品質量安全研究進展

周金慧 張文文 王欣然 張金振 金玥 楊樹鵬 趙文 陳蘭珍 問亞琴王鵬 黃京平 劉婷婷 李熠

（中國農業科學院蜜蜂研究所農業部蜂產品質量監督檢驗測試中心，北京100093）

本文通過查閱2016年國內外涉及蜂產品質量安全的研究論文和專利，分析了其在多個數據庫的產品分類和研究熱點分布情況，進而總結了該領域的最新研究進展。本文主要針對在蜂產品中農獸藥殘留分析、重金屬分析、溯源分析、摻假鑒別等方面的能夠提高分析效率、穩定性、準確度和靈敏度的新方法、新技術以及在原有技術上有較大改進的研究，展開簡單的詮釋和分析。通過探討國內外最新的研究進展，能夠深入、全面地了解同領域內的其他專家關注的焦點，為以后的研究提供更多的研究思路。

蜂產品，質量安全，農獸藥殘留，重金屬分析，溯源分析，摻假鑒別

1 文獻分布情況

截止至2016年12月初，從美國湯姆森科技信息集團（web of science）、谷歌學術（Google Scholar），愛思唯爾（Sciencedirect）、斯普林格（Springerlink）、EBSCO、美國分析化學協會（ACS）、英國分析化學協會（RSC）和Wiley等數據庫搜索結果顯示，2016年大約有169篇與蜂產品質量安全相關的英文文獻被SCI期刊收錄，涉及蜂蜜的有135篇，蜂膠20篇，蜂王漿6篇，蜂花粉4篇，蜂蠟3篇和蜂毒1篇（圖1）。涉及的雜志主要包括Food chemistry、Food Analytical Method、Talanta、Journal of separation Science、Journal Food Additives&Contaminants、Journal of Chromatography A、Journal of Agricultural and Food Chemistry、Journal of the Science of Food and Agriculture、Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis和MethodX等。從中國知網（CNKI）、維普網（VIP）、萬方數據知識服務平臺（wanfangdata）和國家知識產權局檢索數據庫（SIPO）的搜索數據顯示，2016年與蜂產品質量安全相關的中文學術文獻約為74篇，其中涉及蜂蜜的有33篇，蜂王漿10篇，蜂膠18篇，蜂花粉13篇，蜂蠟、蜂毒沒有報道，此外還有6項專利（圖1）。主要涉及分析測試學報、分析化學、食品研究與開發、中國蜂業、食品工業、食品安全質量檢測學報、蜜蜂雜志、光譜學與光譜分析、高等學校化學學報、質量探索、燕山大學學報、山東化工、廣東化工、安徽農業化學、中國食品學報、食品研究與開發、食品科學、江蘇調味副食品和食品工業科技等雜志。

2 研究進展

圖1 2016年國內外蜂產品質量安全研究文獻分布概況

2.1 農藥和獸藥殘留分析

蜂蜜的研究主要包括外源污染物（農藥、獸藥、微生物和重金屬）殘留分析、內源組分分析、溯源分析以及摻假鑒別四個方面。農藥和獸藥殘留分析類的文章主要集中于建立新的樣品前處理方法和儀器分析方法，進而減少雜質干擾，提高痕量分析準確度和靈敏度的方面。重金屬分析主要是利用原子吸收光譜法、原子熒光光譜法、穩定同位素質譜法和電感耦合等離子體質譜法建立不同種類蜂蜜中各種元素的分析方法。此外還利用質譜技術對蜂蜜中芽孢桿菌進行鑒定與分型。內源組分分析主要是利用不同的儀器分析技術分析蜂蜜中的氨基酸、淀粉酶、糖類物質和脂肪酸。溯源分析主要基于蜂蜜的理化性質、揮發性組分、礦物元素、指紋圖譜技術建立蜜源產地和蜜源植物的鑒別方法。而摻假研究主要是集中在蜂蜜中非法添加大米糖漿、淀粉糖漿或其他非法添加劑鑒別方法的開發。

中性解吸-電噴霧萃取電離質譜技術是利用斜對放置的進氣管和樣品管提取和凈化待測樣品，再將樣品流引入電噴霧萃取電離源，帶電液滴與樣品液滴進行碰撞融合，發生液液萃取和電荷轉移進而達到去溶劑的效果，最終對待測物進行質譜分析。該項技術已經用于蜂蜜中農藥和獸藥的殘留分析。基于中性解吸-電噴霧萃取電離質譜，無需樣品預處理即可直接檢測蜂蜜中四環素，檢出限為1.08 ng/ml。同時對市售蜂蜜進行檢測，發現2種蜂蜜中含有痕量的四環素[1]。同樣在無需樣品預處理的條件下，利用該技術建立了蜂蜜中敵敵畏直接快速檢測的方法，檢出限為1.0 ng/ml(S/N= 3)[2]。該技術無需復雜的樣品前處理，靈敏度高、精密度好、分析速度快且特異性強，能夠耐受復雜基質的影響，是一種快速檢測蜂蜜中四環素和敵敵畏的方法，同時也可為其他蜂產品中多種污染物的直接、快速分析提供借鑒和參考。

液液微萃取技術是微量萃取劑在分散劑作用下形成分散的有機微液滴，均勻的分散在樣品水溶液中，從而形成水/萃取劑/分散劑乳濁液體系，目標分析物在水相和微量萃取劑之間達到萃取平衡，并最終分配到有機相中，離心分層，得到目標化合物。其優點是擴大了有機萃取劑和水相之間的接觸面積，加快了萃取平衡的速度，使目標化合物迅速萃入萃取劑中，提高了萃取效率和富集倍數，集采樣、萃取和濃縮于一體，萃取時間短，且方法準確、靈敏，是一種微量殘留的快速檢測方法。親水的離子液體[N4444]Cl和離子交換試劑KPF6可形成疏水的[N4444][PF6]，從蜂蜜中提取苯甲酰脲類殺蟲劑，提取后的溶液在室溫下固化并利用濾膜過濾收集。該方法不需要分散溶劑、渦動混合、超聲提取和離心等步驟[3]。分散液液微萃取技術也用于蜂蜜中有機氯農藥的殘留檢測，1,2-二溴甲烷作為提取劑，乙腈作為分散劑，基于該方法可使有機氯的檢測限和定量限分別達到0.004~0.07ng/g和0.02~0.3 ng/g，提取效率可達91~100%，富集因子范圍為171~199[4]。氯苯作為提取溶劑，加入氯化鈉作為分散劑并提高離子強度，然后通過優化萃取時間和溶劑量來提取蜂蜜中19種農藥，最終利用氣相色譜-質譜定量分析[5]。利用1,2-二溴乙烷作為提取劑，超聲波輔助提取并恢復至室溫，離心后從液滴中吸取樣液定量分析蜂蜜中的毒死蜱和有機氯農藥，該方法的檢出限和定量限分別為0.003~0.06ng/g和0.01~0.2 ng/g，提取效率為91~100%富集因子范圍為168~192[6]。此外，中空纖維液液微萃取法提取和凈化蜂蜜中的磺胺類藥物[7]，鹽去乳化分散液液微萃取法提取和凈化蜂蜜中的三嗪類除草劑[8]，渦動輔助的中空纖維液液微萃取法提取和凈化蜂蜜中的阿苯達唑和三氯苯咪唑[9]，固相萃取結合液液微萃取法提取和凈化蜂蜜中的溴氰菊酯和氯菊酯[10]等，均為在傳統的液液微萃取技術基礎上采取微小的技術改動，從而達到更好的提取和凈化效果，并廣泛應用于蜂蜜中農藥和獸藥的殘留檢測。

QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,ruggedand safe)技術已經在農藥和獸藥殘留研究中得到了廣泛應用。Hsiang等[11]利用酸化乙腈溶解蜂蜜樣品，無水硫酸鈉和氯化鈉用于提取樣品中的酰胺醇類藥物，上清液采用無水硫酸鈉、C18粉、C18封端吸附劑和QuE ZSep填料凈化雜質，串聯質譜定量。蜂蜜中硝基呋喃和硝基咪唑類藥物多殘留分析采用優化過的QuEChERS技術進行提取和凈化，乙腈提取后，加入硫酸鎂和氯化鈉渦動混合凈化雜質，上清液進行衍生化，氮吹復溶后串聯質譜分析[12]。此外，該技術還廣泛應用于多種農藥的殘留分析，其關鍵點在于針對不同的污染物選擇不同的提取劑和凈化填料，并對使用量進行優化[13,14]。

酶聯免疫技術尤其是試劑盒方法在蜂蜜中獸藥的篩查取得了顯著的效果。利用四環素類藥物作為半抗原偶聯蛋白后制備單克隆抗體，同時然后利用檸檬酸鈉還原法制備膠體金，進而制備膠體金標記單克隆抗體生產試紙條。利用基于試紙條的免疫色譜法快速定性和定量分析蜂蜜中殘留的四環素類藥物[15]。

分子印跡技術是指當模板分子（印跡分子或代測物）與聚合物單體接觸時會形成多重作用點，通過聚合過程這種作用就會被記憶下來，當模板分子除去后，聚合物中就形成了與模板分子空間構型相匹配的具有多重作用點的空穴，這樣的空穴將對模板分子及其類似物具有選擇識別特性。基于親水分子印跡樹脂建立了蜂蜜中三嗪類除草劑的液相色譜串聯質譜法，其中利用間苯二酚和三聚氰胺作為雙功能單體，甲醛作為交聯基團，莠滅凈作為模板縮聚合成分子印跡樹脂。該方法檢測限范圍可達0.02~0.15 ng/g，回收率范圍為83± 4~97±4%[16]。Madiha等建立了基于免疫印跡技術的生物傳感器檢測蜂蜜中殘留的四環素，苯胺功能化的金納米顆粒通過電聚合制備分子印跡聚合物，檢測限可達2.24×10-16M，回收率范圍為101.8~106.0%，相對標準偏差小于8.3%[17]。

電化學技術在污染物的定量分析中也得到了廣泛的應用。電極傳感器技術包括差分脈沖，方波和吸附溶出伏安法已經在污水、河水、人尿、制藥和牛奶樣品中四環素測定方面取得一定的研究進展。銻膜微電極傳感器技術也可應用于蜂蜜中四環素類藥物的殘留檢測，首先利用方波陰極溶出伏安法和玻璃碳電極制備銻膜電極傳感器，基于高效的Draper Lin組分設計方法優化pH值和銻濃度等參數，最終在0.40～3.00 μM濃度范圍內檢測限可達0.15 μM[18]。此外利用垂直二氧化硅的二元組裝改性的氧化銦錫電極介電膜和圓柱形表面活性劑膠束結合的電化學檢測技術可檢測蜂蜜中殘留的氯霉素。在直徑為2～3nm的硬電極介電膜支持和限定的十六烷基三甲基溴化銨的軟表面活性劑膠束，其具有能夠從樣品溶液中提取和濃縮親脂性有機物質中碳氫化合物的能力。因此，表面活性劑膠束和電極介電膜修飾的電極表現出的針對氯霉素的分析能力優于裸露和垂直硅孔道修飾的電極。在優化條件下使用差示脈沖伏安法獲得用于氯霉素分析的兩個線性動態濃度測定范圍，即0.1～3.6 mg/kg和3.6～15.0mg/kg，并獲得了檢測低限40μg/kg[19]。

蜂王漿和蜂膠中的污染物殘留也是不容忽視的問題。利用快速溶劑萃取-凝膠滲透色譜凈化-液相色譜串聯質譜法能夠提取、凈化并定量測定蜂花粉中硝基咪唑類化合物，樣品以乙酸乙酯為萃取溶劑經快速溶劑萃取儀萃取，凝膠滲透色譜(GPC)凈化，采用Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱分離，以0.15%甲酸溶液(A)-甲醇(B)為流動相。質譜采用多反應監測正離子掃描模式，基質匹配標準曲線同位素內標法定量。硝基咪唑類化合物檢出限為1.5μg/kg，定量限為5.0μg/kg[20]。蜂蜜和蜂王漿中四環素殘留檢測方法較多也相對成熟，但是蜂膠中的報道較少，這是由于蜂膠基質非常復雜，含有大量的黃酮和酚酸類物質等，分析過程中受基質的影響很大，導致分析結果準確度下降，所以蜂膠中抗生素的檢測方法有待進一步的研究和發展。研究中發現，采用Mcllvaine緩沖溶液提取蜂膠中的四環素殘留，以結構和性質相似的地美環素和甲烯土霉素作為四環素類目標物的內標，采用Oasis HLB柱凈化雜質，通過分析比較提取液、內標的選擇對試驗結果的影響，確定試驗方法的線性范圍和定量限，建立的高效液相-質譜聯用法，回收率在74.1～118.8%之間，RSD＜15%，能夠滿足蜂膠產品中四環素藥物殘留的常規檢測要求[21]。

2.2 金屬元素分析

金屬元素通常根據密度大小分為重金屬、輕金屬和準金屬元素等。蜂產品本身就含有鐵、鈣、銅、鉀等多種有益人體健康的微量元素，此外由于我國土壤和環境中的重金屬污染日益嚴重，所以蜂產品中也經常殘留鉛、砷和汞等對人體有極大危害的重金屬元素。目前測定蜂蜜中元素的方法主要有基于微波消解法的原子吸收光譜法、原子熒光光譜法、電感耦合等離子體發射光譜法和電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）法。采用微波消解法同時提取蜂蜜、蜂王漿、蜂膠和蜂花粉中的鉛、砷、汞，鉛的趕酸溫度為160℃，砷、汞的趕酸溫度為110℃，該溫度條件既能防止汞的揮發，又能有效提高工作效率[22]。椴樹蜂蜜是我國東北地區特色蜜種，采用濕法消解處理椴樹蜜樣品，電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）法測定鋁元素含量，稱取椴樹蜜試樣于高硼硅消解管中，加入硝酸置于電熱消解儀上預處理，然后升溫至120℃消解2h，其后將樣品在150℃消解至澄清透明，趕酸后將樣品轉入50ml容量瓶中，定容搖勻，回收率在95.83～115.50%之間，線性相關系數為0.9999，RSD＜2.62%。該方法測定快速準確，適于蜂蜜中鋁元素的測定[23]。應用微波消解-電感耦合等離子體質譜(ICPMS)分析椴樹蜂蜜樣品，取蜂蜜樣品于離心管中，在水浴中超聲處理，直到蜂蜜樣品呈清澈液態，然后將蜂蜜樣品置于酸煮洗凈的中壓消解罐中，加入硝酸和雙氧水，旋緊頂蓋放入微波消解儀內，按照設定的消解程序進行微波消解。消解完畢后，待樣品冷卻至室溫，打開消解罐，將消解液轉移至離心管中，并用去離子水洗滌消解罐及蓋子3次，合并洗液至離心管中，定容至刻度，混勻，待測分析。每次消解過程中均同時制備空白試樣和標準物質試樣。使用該方法可同時測定椴樹蜂蜜中23種元素的含量[24]。為解決電感耦合等離子體質譜儀測定蜂王漿中硒含量時產生的干擾問題，應用動態反應池（DRC）技術，通過對反應氣種類、流量及測定元素同位素的優化，確定了消除干擾的方法。實驗結果表明，當以78Se為分析物，甲烷（CH4）為反應氣時，可有效降低干擾[25]。蜂膠中常見重金屬鉛(Pb)、砷(As)、汞(Hg)、鎘(Cd)和鉻(Cr)的分析過程中的非質譜干擾主要源于樣品基質效應進而影響ICP-MS分析中許多過程，如氣溶膠的產生、氣溶膠的引入離子在接口處的提取和正離子束在質譜中間的傳輸等復雜過程。通過選擇合適的內標元素以盡可能地消除非質譜干擾。分析過程中的質譜干擾主要源于不能分辨相同質量物質的干擾，包括同量異位素干擾、多原子干擾以及雙電荷離子干擾等。通過選擇無干擾的待測元素同位素、引入He碰撞反應池技術以及減少含水量、降低樣品和載氣流速等優化工作條件，以減少在等離子中形成干擾[26]。

（未完待續）

國家蜂產業技術體系專項資金資助(CARS-45)。

李熠，研究員，從事蜂產品質量安全研究與評價工作，E-mail:bricaas_liyi@126.com