濕法消化法測定蜂花粉中鉛的研究

周萍邵巧云趙煥徐權華陳佳瑋胡福良

（1杭州蜂之語蜂業股份有限公司，桐廬311500；2浙江大學動物科學學院，杭州310058）

濕法消化法測定蜂花粉中鉛的研究

周萍1邵巧云1趙煥1徐權華1陳佳瑋2胡福良2

（1杭州蜂之語蜂業股份有限公司，桐廬311500；2浙江大學動物科學學院，杭州310058）

本文建立了濕法消化-原子吸收光譜法測定蜂花粉中鉛的方法。實驗優化表明，最佳消化程序為：70℃0.5 h→140℃1 h→180℃6~10 h（至溶液變淺黃）；石墨爐最佳溫升：干燥溫度120℃，灰化溫度500℃，原子化溫度1900℃，清殘余溫度2200℃；最佳稱樣量0.25 g～0.30 g。該方法條件下，線性范圍在5~80 ng/ml之間，線性方程為y= 0.0024x-0.0009，R2=0.9988，線性關系良好。方法回收率在95.2~100.1%之間，n=3。精密度RSD為3.05%，n=6。結合實際檢測結果，為GB 2762蜂花粉中鉛的指標限量提出了合理指標建議。

蜂花粉；鉛；測定方法；限量要求

蜂花粉是工蜂采集花粉，用唾液和花蜜混合后形成的物質[1]，廣泛用于醫藥、食品和日化用品行業。由于重金屬鉛是蓄積性毒物，其污染可以通過食物鏈傳遞、富集和放大，長期攝入可導致人體慢性中毒[2，3]。為了加強蜂花粉作為食品、藥品使用的安全性和質量標準控制，我國規定蜂花粉中鉛的限量要求是0.5 mg/kg[4]。自2013年以來，我國政府監管機構通過市場抽查的方式，對蜂花粉產品進行鉛的檢測，已經有多家企業的產品被檢測到鉛的含量超過了限量要求。

目前蜂花粉中鉛的檢測方法主要有：電感耦合等離子體原子發射光譜法[5-8]，電感耦合等離子體質譜法[9，10]，原子吸收分光光度法[11-14]。其中，電感耦合等離子體原子發射光譜法和電感耦合等離子體質譜法能夠同時進行多種元素分析，但是儀器昂貴。原子吸收分光光度法作為經典的鉛檢測方法，具有靈敏度高、準確性好等特點。檢測蜂花粉中的鉛時，文獻多采用微波消解、干法消化等樣品前處理技術，微波消解儀雖然有消解時間短、鉛損失小的優點，但是儀器的價格不菲，而干法消化需要高溫馬弗爐，大多不能一次消化完全，操作繁瑣又不方便，鉛也有不同程度損失。濕法消化步驟雖稍繁瑣，卻操作簡單，成本低廉，準確度高，儀器簡單，適合大多數企業使用。由于現有檢測標準方法未細化濕法消化條件、最佳稱樣量和最佳石墨爐加熱程序，故沒有得到很好的應用。本文依據GB 5009.12食品中鉛的測定標準方法，研究了蜂花粉樣品的濕法消化升溫程序、最佳稱樣量、消化總時間、基體改進劑添加量對檢測結果的影響，確定了簡單實用的濕法消化前處理方法和石墨爐升溫程序，同時對蜂花粉中鉛進行測定，結果顯示該方法效果良好。

由于蜂花粉中鉛超過GB 2762規定的限量要求而被通報和處理的現象時有發生，為此，本文還對蜂花粉中鉛的現狀進行了綜合分析，并提出合理的蜂花粉中鉛的限量建議，供今后修訂GB 2762時參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鉛標準品（1 mg/ml，中國藥品生物制品檢定所）；磷酸二氫銨為分析純；硝酸、高氯酸均為優級純；雙重蒸餾水。

0.5 mol/L硝酸溶液：取3.2ml硝酸加入50ml水中，稀釋至100ml。

磷酸二氫銨溶液（80 g/L）：稱取8.0 g磷酸二氫銨，以水溶解稀釋至100ml。

混合酸：硝酸+高氯酸（9+1），取9份硝酸與1份高氯酸混合。

實驗樣品：油菜蜂花粉、茶花花粉、荷花花粉（杭州蜂之語蜂業合作社、江山健康食品有限公司提供），精制花粉顆粒，批號：20150113（杭州蜂之語蜂業股份有限公司提供）。

1.2 儀器與設備

北京普析通用儀器有限責任公司TAS-990石墨爐原子吸收分光光度計；Sartorius BS224S分析天平；LICHEN邦西儀器科技（上海）有限公司DB-1EFS智能石墨電熱恒溫加熱板。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱取經過研磨的試樣0.25~0.30 g（精確到0.0001 g）于高型石英燒杯中，放數粒玻璃珠，加8ml混合酸，加蓋浸泡過夜，上加一無柄小漏斗（下部孔徑0.5cm），置于電熱板上加熱消解，加熱程序：70℃0.5 h→140℃1 h→180℃6～10 h（至溶液變淺黃色），控制消化溫度不超過180℃，液體呈微沸狀態。當樣液體積減少至1~ 2ml時，消化液應呈透明的無色或淺黃色，即是消化完全狀態。當液體少于2ml且消化尚未完全時，則需補加混合酸2ml，繼續至消化完全。取下放冷，用塑料滴管將消化液洗入10ml容量瓶中，用水少量多次洗滌高型石英燒杯，定容混勻備用；同時做試劑空白及添加回收。

1.3.2 標準溶液及標準曲線制備

鉛標準儲備液：1 mg/ml，4℃下保存，36個月有效。

鉛標準中間液：每次吸取鉛標準儲備液1.0ml于 10ml容量瓶中，加硝酸（0.5 mol/L）或硝酸（1 mol/L）至刻度，配制成0.1 mg/ml中間標準液（1ml分裝于1.5ml塑料離心管中，4℃下保存，12個月有效）。

鉛標準臨時標準液：分別吸取鉛標準中間液100μl于1.5ml塑料離心管中，加硝酸（0.5 mol/L）或硝酸（1 mol/L）900μl，搖勻，配制成0.01 mg/ml臨時標準1液。

吸臨時標準1液100μl于1.5ml塑料離心管中，加入硝酸（0.5 mol/L）或硝酸（1 mol/L）900μl，用移液槍沖勻，配制成0.001 mg/ml臨時標準2液，做添加之用。

吸臨時標準1液100μl于10ml塑料離心管中，加硝酸（0.5 mol/L）或硝酸（1 mol/L）900μl，重復1次，搖勻，配制成2ml 0.0001 mg/ml臨時標準3液。

鉛標準使用液：分別吸臨時標準3液100μl、200μl、400μl、800μl于1.5ml塑料離心管中，加硝酸（0.5 mol/L）或硝酸（1 mol/L）900μl、800μl、600μl、200μl，分別搖勻，再用移液槍沖勻，配制成每ml含10.0，20.0，40.0，80.0 ng鉛的標準使用液（可根據樣品所含濃度調整配制），取20.0 ng/mL的標準液250μl，加硝酸（0.5 mol/L）或硝酸（1 mol/L）750μl，搖勻，成為每毫升含5.0 ng鉛的標準使用液，從而配制成5.0，10.0，20.0，40.0，80.0 ng鉛的系列標準使用液。同1.3.3樣品測定方法，測定鉛的系列標準使用液的吸光度，以吸光度為縱坐標，鉛標準液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.3.3 樣品測定

1.3.3.1 原子吸收分光光度計參數設定

通過對管理理念進行創新，能夠有效的提升公路工程施工效率。在競爭激烈的工程行業當中，面對日新月異的變化，過去傳統的施工管理理念與施工技術已經很難適應時代的發展要求，因此，要想讓企業在競爭中能夠繼續生存和發展，就要轉變觀念，根據當前公路工程施工管理與施工技術中面臨的問題，結合企業自身發展，創新和完善管理理念，進而推動企業的健康發展。

根據儀器性能及說明書調至最佳狀態，見表1。

表1 原子吸收分光光度計鉛測定儀器條件

1.3.3.2 樣品測定

含基體改進劑：分別吸取樣液和試劑空白液各800μl，加入200μl基體改進劑-磷酸二氫銨溶液（80 g/L），混合30 s，移液槍沖勻，吸取12.5μl注入石墨爐，測得其吸光度。

不含基體改進劑：分別吸取樣液和試劑空白液10.0μl注入石墨爐，測得其吸光度。

以上結果，代入標準系列的一元線性回歸方程（1.3.2）中求得樣液中鉛含量，計算結果保留兩位有效數字。

2 結果與分析

2.1 消化條件的優化

2.1.1 消化程序的選擇

在濕法消化過程中，鉛離子與其他溶液中的陰離子結合形成鉛鹽，在一定溫度下，仍然存在鉛損失的風險，為了確定消化最高溫度，特選取140℃、160℃、180℃、200℃、220℃對樣品進行消化，均消化至溶液呈透明淺黃色或者無色，并冒白煙，總消化時間不超過11.5 h，用蒸餾水定容至10ml，測定樣液吸光度，結果見圖1。

圖1 不同最高消化溫度對吸光度的影響

市售濃硝酸的沸點約為121℃，純高氯酸的沸點是130℃，故不能快速升溫消化，將消化程序設定電熱板初始溫度為70℃。經過試驗觀察，隨著溫度升高，樣品開始冒棕色煙霧，70℃0.5 h后，樣液反應趨于平緩，再設定加熱板溫度為140℃，隨著溫度升高，樣品又開始冒棕色煙霧，0.5 h后，樣液反應趨于平緩，為保證該溫度下的反應完全，繼續加熱0.5 h后將加熱板溫度調至最高的消化溫度，保持至反應結束。從圖1可以看到，當最高消化溫度為180℃時，吸光度最高。故選擇最佳消化程序為：70℃0.5 h→140℃1 h→180℃6~10 h。

消化時間與稱樣量關系非常大，由于蜂花粉中鉛的限量要求為0.5 mg/kg，故設定稱樣量為0.25 g，0.30 g,0.40 g，0.45 g和0.50 g，分別按確定的消化程序進行消化，發現當稱樣量為0.25 g，0.30 g時，能夠在規定的時間內消化完全，而0.40 g，0.45 g和0.50 g的樣液仍然是棕色的，表示消化沒有完全。故選擇最佳稱樣量為0.25～0.30 g。當稱量為0.25 g時，按本文的檢測方法，蜂花粉中鉛的定量限為0.2 mg/kg，可以滿足日常生產的監控要求。

2.1.3 消化時間的選擇

不同的蜂花粉樣品，由于成分相對存在差異，所以消化時間也不盡相同。特別地，對油菜花粉進行消化總時間的考察，發現消化8 h后，反應已經完全，180℃下繼續消化1，2，3，4小時后，用蒸餾水定容至10ml，測定樣液吸光度，結果見圖2。

圖2 不同消化總時間對吸光度的影響

由圖2可知，在本消化程序條件下，消化總時間在12 h內，對吸光度無顯著影響。

2.2 灰化溫度的選擇

2.2.1 無基體改進劑時的灰化溫度

石墨爐加熱程序直接影響檢測結果，由于鉛容易揮發，故灰化階段的溫度為關鍵控制點，干燥溫度直接關系到灰化是否徹底，灰化溫度則關系到試樣是否灰化完全及鉛的損失大小。為保證樣液干燥徹底，干燥溫度為120℃/15 s，保持15 s。設定10 s內達到灰化溫度400℃、500℃、600℃、700℃、800℃，保持15 s，其他條件參考儀器使用說明書，測定吸光度。結果：500℃時，吸光度最大，故選擇灰化溫度為500℃。

2.2.2 有基體改進劑時的灰化溫度

基體改進劑可提高鉛的灰化溫度，排除其他元素的干擾，樣品中當某種元素含量特別高時，尤其適用。本文以GB 5009.12中提到的基體改進劑磷酸二氫銨，配制成80 g/L濃度，如2.2.1研究了樣品最佳灰化溫度為800℃。

2.3 方法穩定性

精密稱取樣品（精制蜂花粉顆粒，杭州蜂之語蜂業股份有限公司生產，批號：20150113）0.25 g，添加2 μg/ml鉛標準溶液125μl，按1.3.1要求對樣品進行操作處理，在室溫下，分別在0，1，2，4，6，8 h按1.3.3方法測定，記錄其吸光度，RSD=3.77%（n=6），符合GB/T 27404對檢測結果精密度的要求，表明處理后的樣液在6 h內穩定性良好。

2.4 方法的線性范圍、回收率和精密度

按本方法進行測定，線性范圍：5.0 ng/ml～80.0 ng/ml，線性方程：y=0.0024x-0.0009，R2=0.9988，線性關系良好。取批號為20150113的精制蜂花粉顆粒樣品，進行6次平行試驗，RSD=3.05%，表明本方法精密度良好，符合GB/T 27404關于精密度的要求。稱取0.25 g批號為20150113的精制蜂花粉顆粒樣品，添加2 μg/ml鉛標準溶液125μl（添加濃度1 mg/kg），進行添加回收試驗，試驗結果：樣品回收率95.2～100.1%（n=3），表明本方法準確度良好，符合GB/T 27404關于準確度的要求。

2.5 蜂花粉中鉛的測定

檢測了市場上常見的蜂花粉：油菜蜂花粉、茶花花粉、荷花花粉和精制花粉顆粒中的鉛含量，蜂花粉樣品隨機采購，未考慮地域、時間的限制，檢測結果如表2。

表2 蜂花粉中鉛的測定結果

總共檢測了7個樣品，合格率43%，與文獻報道的結果基本一致。

3 蜂花粉中鉛的限定建議

據中國蜂產品協會蜂花粉專業委員會的業內專家說，我國蜂花粉中鉛含量有40%～60%大于GB 2762中關于蜂花粉鉛限量的值。何燕等[5]調查了14種來自于不同產地的71個花粉樣品，結果鉛含量大于0.5 mg/kg的樣品有43個，占總數的61%。浙江大學楊開等[7]對12種花粉中的鉛進行了測定，結果大于0.5 mg/kg的占50%，最大值為4.77 mg/kg。曾志將等[8]檢測了除常規蜂花粉外的14種其他粉源植物蜂花粉中的鉛含量，結果大于0.5 mg/kg的樣品有9個，占總數的64%。這些文獻的報道與業內專家的說法一致。

我們又調查了蜂蜜中關于鉛的限量，GB 2762中規定鉛限量為1 mg/kg。2013年，安徽國家農業標準化與監測中心的夏春、高柱、臧愛香，用微波消解-電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS）測定了4種常見蜂蜜中的多種元素[15]，結果鉛含量為0.005～0.03 mg/kg，中國農業科學院陳蘭珍等[16]測定了6種蜂蜜中的微量元素和重金屬，結果鉛含量為0.014～0.031 mg/kg，遠低于GB 2762中規定的鉛限量1 mg/kg。因此，我們對GB 2762中規定鉛限量的依據存在疑問。

曾志將等[11]對花粉和蜂蜜兩者中礦物質含量進行了相關性分析，結論是蜂花粉是蜂蜜中鉛的重要來源，而GB2762中關于蜂花粉、蜂蜜鉛限量卻是倒置的，規定了蜂花粉中鉛限量為0.5 mg/kg，蜂蜜卻是1 mg/kg，與實際檢測結果明顯不符。蜂花粉可作為保健食品原料，在GB 16740保健食品中，保健食品中鉛的限量是2.0 mg/kg。故目前GB2762關于蜂花粉的鉛限量的設定與實際情況脫離，也無科學性，一定程度上制約著行業的發展。

以上分析意味著，如果不對蜂花粉原料進行鉛限量的控制，那么蜂花粉中鉛超標的可能性高達60%，這對于蜂花粉行業的發展是極其不利的，有關標準制訂部門、政府監管部門應該對此事加以重視。

綜上所述，建議相關標準起草單位和起草人，參考GB 16740確定蜂花粉中的鉛限量要求為2 mg/kg。

[1]GB/T 30359-2013蜂花粉[S].2013.

[2]段明革，馬會國，郎明林.微波消解-石墨爐原子吸收光譜法測定蔬菜中微量鉛和鎘[J].中國衛生檢驗雜志,2006,16(11): 1350-1351.

[3]陸龍根.植物類中藥材中砷、鎘和鉛的含量及安全性評價[J].微量元素與健康研究,2003,20(1):51-52.

[4]GB 2762-2012食品安全國家標準食品中污染物限量[S]. 2012.

[5]何燕，曹麗玲，王可，等.ICP-AES法分析蜂花粉中10種金屬元素及含量調查[J].醫學動物防制,2011,27(3):255-259.

[6]楊立學，趙川，陳淑玲.ICP-AES測定花粉中10種微量元素的方法研究[J].職業與健康,2010,26(12):1357-1358.

[7]楊開，何晉浙，胡君榮，等.12種花粉中20種常量和微量元素的ICP-AES法測定[J].中國食品學報,2010,10(3):227-232.

[8]曾志將，顏偉玉.花粉中礦物質研究[J].中國蜂業,2002,53(4): 9-11.

[9]周小玲，王永寧，石玉平.微波消解-ICP-MS測定青海油菜蜂花粉中微量元素[J].光譜實驗室,2010,27(3):1181-1184.

[10]溫力力，任露陸，郭新東，等.ICP-MS法測定蜂花粉中的微量元素含量[J].現代食品科技,2012,28(8):1076-1079.

[11]曾志將，顏偉玉.花粉和蜂蜜兩者中礦物質含量相關性分析[J].蜜蜂雜志,2002(1):3-4.

[12]陳良璧，閻永賢，周萬森.基體改進效應用于測定花粉中痕量鉛、鎘的石墨爐原子吸收法研究[J].光譜學與光譜分析,1986,7 (3):63-66.

[13]張萍，盧俊杰.微波消解-石墨爐原子吸收光譜法測定蜂花粉中鉛、鎘和銅[J].光譜實驗室,2012,29(3):1416-1419.

[14]梁保安，付華峰.原子吸收光譜法測定花粉中的微量元素[J].光譜學與光譜分析，2007,27(8):1640-1643.

[15]夏春，高柱，臧愛香.用微波消解-電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS）測定蜂蜜中的多種元素[J].現代農業科技,2013(2): 278-279.

[16]陳蘭珍，芮玉奎，趙靜，等.應用ICP-MS測定不同種類蜂蜜中的微量元素和重金屬[J].光譜學與光譜分析,2008,28(6): 1403-1405.

Determination of lead in bee pollen by wet digestion method

Zhou Ping,Shao Qiaoyun,Zhao Huan,Xu Quanhua,Chen Jiawei,Hu Fuliang
(1 Hangzhou Beewords Apiculture Co.Ltd.,Tonglu 311500,China;2 Animal Science College of Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

A wet digestion atomic absorption spectrometry method was established for the determination of lead in bee pollen.The results showed that the optimal extracting technological conditions were as follows:the best digestion procedures used for 70℃→0.5 h,140℃→1 h,180℃→6~10 h(until solution became pale yellow).The optimal temperature rise of graphite furnace was that dried at 120℃,ashed at 500℃,atomized at 1900℃,and clear residual temperature was 2200℃.The best sample weight was 0.25 to 0.30 g.Under the condition of the method,the linear range was range from 5 ng/ml to 80 ng/ml,the linear equation was y=0.0024x-0.0009,R2=0.9988,showed a good linear correlation.The recovery of the method was 95.2~100.1%,n=3.The precision of the results showed that RSD was 3.05%,n=6.Based on the actual test results,the reasonable index of the lead in the GB 2762 bee pollen was put forward.

bee pollen;lead;determination method;limit requirement

周萍（1969-），男，高級工程師，主要從事蜂產品品質管理與檢測、食品技術與新產品開發工作，E-mail:tdbjhn@126.com

胡福良（1964-），男，教授，博導，主要從事蜜蜂科學研究，E-mail:flhu@zju.edu.cn