異丙酚對大鼠前扣帶回突觸傳遞的影響

曹 青王蕊蕊曹永孝*

（1 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，陜西 西安 710061；2 第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院疼痛生物醫(yī)學(xué)研究所，陜西 西安 710038）

異丙酚對大鼠前扣帶回突觸傳遞的影響

曹 青1王蕊蕊2曹永孝1*

（1 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，陜西 西安 710061；2 第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院疼痛生物醫(yī)學(xué)研究所，陜西 西安 710038）

目的 探討異丙酚對大鼠前扣帶回突觸傳遞的影響。方法 應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，在成年大鼠前腦前扣帶回區(qū)域（ACC）腦片上觀察異丙酚對ACCⅡ/Ⅲ突觸傳遞的影響。結(jié)果 不同濃度的異丙酚能夠劑量依賴性的顯著增強(qiáng)ACCⅡ/Ⅲ層神經(jīng)元GABA能微小抑制性電流（mIPSC）的幅度和半波寬，但對其頻率沒有顯著影響。而對于微小興奮性的突觸后電流（mEPSC），異丙酚對ACCⅡ/Ⅲ層神經(jīng)元mEPSC的頻率，幅度半波寬都無顯著影響。結(jié)論 異丙酚對ACCⅡ/Ⅲ層神經(jīng)元興奮性突觸傳遞沒有直接的影響，但是卻可以通過延長GABA受體的平均開放時間和增加突觸后GABAA受體的數(shù)目來增強(qiáng)抑制性突觸傳遞的效果。

異丙酚；前扣帶回；突觸傳遞

異丙酚是一種靜脈全身麻醉藥，其作用可能作用中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的GABAA受體，增強(qiáng)GABA與GABAA受體結(jié)合引起的效應(yīng)。而GABA作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)在傷害性信息調(diào)制中發(fā)揮著重要的作用。異丙酚作為GABA和甘氨酸的調(diào)節(jié)器，對傷害性刺激所引起的疼痛在脊髓水平有鎮(zhèn)痛作用，其作用機(jī)制可能是增強(qiáng)脊髓膠狀質(zhì)神經(jīng)元突觸后GABAA受體的反應(yīng)[1]。異丙酚在脊髓上水平同樣有鎮(zhèn)痛作用，有研究證明異丙酚能夠抑制福爾馬林炎性痛大鼠前扣帶回（ACC）ERK的激活[2]。而ACC是接受和調(diào)制痛覺信息的重要中樞，在疼痛的動機(jī)-情感和認(rèn)知-評價等神經(jīng)信息處理過程中發(fā)揮著重要的作用[3]。但是異丙酚在ACC作用的部位及其具體分子細(xì)胞機(jī)制我們還不得而知。本實驗采用全細(xì)胞膜片鉗記錄方法觀察異丙酚對大鼠前扣帶回ACC神經(jīng)元興奮性及抑制性突觸傳遞的影響，以進(jìn)一步探索異丙酚在脊髓上水平鎮(zhèn)痛的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料：實驗動物為4～5周齡雄性SD大鼠，均來自西安交通大學(xué)動物中心。單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)水，同時保證恒定溫度、濕度，光暗周期為12 h。

1.2 方法：用DMSO將異丙酚標(biāo)準(zhǔn)品（西安力邦制藥公司）稀釋成

0.3、0.6、3 μmol/L 3個濃度，并置于-20 ℃存儲。實驗室將其加入人工腦脊液中使用。

1.2.1 ACC薄片的制備：成年雄性SD大鼠 (4～5周齡) ，體質(zhì)量80～100 g。用烏拉坦（1.29 g/kg）腹腔麻醉，然后迅速斷頭，剝離全腦組織，將其放在預(yù)先充氧的冰凍的人工腦脊液中，用解剖刀片修理腦塊，最后將含有ACC的腦塊置于振動切片機(jī)（DTK-1000DosakaEM，Japan）上切取厚度為400 μm 左右的薄片，室溫下孵育1 h。

1.2.2 全細(xì)胞膜片鉗記錄：將經(jīng)孵育的ACC薄片移入半浸式腦片灌流槽，將蠕動泵的流速調(diào)至2.2～2.6 mL/min，首先在低倍鏡（×10）下尋找ACCⅡ/Ⅲ錐體神經(jīng)元。之后切換到高倍鏡（水鏡x40）尋找表面光滑，輪廓清晰的神經(jīng)元，并將其移至視野正中央。找到細(xì)胞后，再次轉(zhuǎn)換回低倍鏡，安放電極。實驗中所用記錄電極阻抗一般為2～4 MΩ。我們用含Cs電極內(nèi)液（其成分：單位mmol/L：Cs2SO4，110；CaCl2，0.5；MgCl2，2；EGTA，5；HEPES，5；etraethylammonium-Cl，5）；用CsOH調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4，滲透壓為290～320 mOsm。將鉗制電壓置于0 mV，在TTX存在的情況下，在ACSF中加入20 μmol/L的Bicuculline用來阻斷GABA受體介導(dǎo)的抑制性突觸后電流，記錄GABA能mIPSC。將鉗制電壓置于-70 mV時記錄在ACSF中加入抑制性突觸后電流拮抗劑Bicuculline記錄mEPSC。所有的記錄與刺激程序都通過美國AxonDigidata1440A放大器控制。此外，實驗過程如果電阻Rs變化超過30%，或靜息膜電位小于-50 mV，則舍棄不用。

1.3 數(shù)據(jù)采集與分析：用MiniAnalysis（Synaptosoft，Decatur，GA）軟件采集GABA受體介導(dǎo)的mIPSCs和AMPA受體介導(dǎo)的mEPSC和的頻率和幅度，所采集的電生理數(shù)據(jù)利用Clampfit9.0和SPSS統(tǒng)計軟件13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用獨(dú)立樣本t檢驗，顯著性差異取P＜0.05。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度的Propofol對ACCⅡ/Ⅲ層GABA能mIPSC的作用：將鉗制電壓鉗制到0 mV，在ACSF中給予1 μmol/L TTX阻斷動作電位依賴的神經(jīng)元之間的沖動傳遞，并加入1 μmol/L Str阻斷甘氨酸受體介導(dǎo)的電流并記錄5 min作為對照。接著給予3種不同劑量的propofol后記錄5 min。比較給藥前后GABA能mIPSC的頻率、幅度和半波寬，我們發(fā)現(xiàn)給予3種不同劑量的propofol能夠顯著增強(qiáng)ACCⅡ/Ⅲ層神經(jīng)元GABA能mIPSC的幅度和半波寬，與對照組相比幅度分別延長[（25.77 ±14.89）%；（35.72±8.9）%；（60.91±15.67）%]，半波寬延長[（40.91±20.11）%；（80.22±17.89）%；（88.89±16.98）%；P＜0.05]，而不同濃度的propofol對GABA能mIPSC的頻率無明顯影響

2.2 Propofol對ACCⅡ/Ⅲ層AMPA受體介導(dǎo)的mEPSC的作用：將鉗制電壓鉗制到-70 mV，ACSF中加入Bicuculline和Str阻斷抑制性電流后記錄5 min作為對照。后給予propofol記錄5 min。比較給藥前后mEPSC頻率、幅度半波寬。我們發(fā)現(xiàn)propofol對ACCⅡ/Ⅲ層神經(jīng)元mEPSC的頻率，幅度半波寬都無顯著影響（P＞0.05，n=8）。

3 討 論

本次實驗發(fā)現(xiàn)異丙酚能夠顯著延長ACCⅡ/Ⅲ層神經(jīng)元GABA電流介導(dǎo)的mIPSC，這種延長程劑量依賴性。而對AMPA受體介導(dǎo)的mEPSC沒有顯著的作用。這些結(jié)果提示異丙酚能夠增強(qiáng)ACCⅡ/Ⅲ層神經(jīng)元突觸后GABAA受體介導(dǎo)的抑制性作用，這可能是異丙酚在脊髓上水平鎮(zhèn)痛的主要機(jī)制。

異丙酚的麻醉和鎮(zhèn)靜作用在脊髓上水平如海馬和大腦皮層中已有研究，這些研究證明異丙酚主要增強(qiáng)突觸后GABA受體介導(dǎo)的反應(yīng)[4]。在脊髓水平，異丙酚能夠抑制傷害性傳遞，其部分原因可能是增強(qiáng)了脊髓膠狀質(zhì)突觸后GABAa受體介導(dǎo)的反應(yīng)[1]。與此結(jié)果一致，我們的實驗發(fā)現(xiàn)異丙酚能夠顯著延長ACCⅡ/Ⅲ層神經(jīng)元GABA電流介導(dǎo)的mIPSC的幅度和半波寬，而異丙酚引起mIPSC的幅度和半波寬的改變主要是藥物作用與突觸后GABAA受體和GABA受體通道開放的概率。

綜上所述，異丙酚對ACCⅡ/Ⅲ層神經(jīng)元興奮性突觸傳遞沒有直接的影響，但是卻可以通過延長GABA受體的平均開放時間和增加突觸后GABAA受體的數(shù)目來增強(qiáng)抑制性突觸傳遞的效果，這可能是異丙酚在脊髓上水平產(chǎn)生抗傷害性作用的部分機(jī)制。

[1] Takazawa T,Furue H,Nishikawa K,et al.Actions of propofol on substantia gelatinosa neurones in rat spinal cord revealed by in vitro,andinvivo,patch-clamp recordings[J].Eur J Neurosci,2009, 29(3):518-528.

[2] 曹紅,高永靜,任文華,等.大鼠前扣帶皮層ERK/MAPK信號通路在痛厭惡情緒形成中的作用[C].中國神經(jīng)心理學(xué)學(xué)術(shù)會議,2005.

[3] Gong KR,Cao FL,He Y,et al.Enhanced excitatory and reduced inhibitory synaptic transmission contribute topersistent paininduced neuronal hyper-responsiveness in anterior cingul atecortex [J].Neuroscience,2010,171(4):1314-1325.

[4] Yang J,Uchida I.Mechanisms of etomidate potentiation of GABA A receptor-gated currents incultured postnatal hippocampal neurons [J].Neuroscience,1996,73(1):69-78.

R614；R-332

B

1671-8194（2017）17-0032-02

*通訊作者