針刺作用及機械力刺激對成纖維細胞的影響*

張小紅,蔡定均,王 宇,黃士其

(成都中醫藥大學，成都 610000)

針刺作用及機械力刺激對成纖維細胞的影響*

張小紅,蔡定均△,王 宇,黃士其

(成都中醫藥大學，成都 610000)

成纖維細胞作為穴區主要的感受性細胞和效應性細胞，在接受針刺的機械刺激后其細胞形態結構、周長和橫截面積等均會發生規律性改變。同時機械力刺激還能促進成纖維細胞增殖、相關生長因子的合成與釋放及細胞骨架重構等，這一系列變化的發生可能與力學效應激活成纖維細胞膜上的整合素和MAPK信號傳導通路有關，從而導致機械力作用向生物化學信號的轉換，由此推斷成纖維細胞的改變在針刺的力傳導途徑中具有重要的研究意義。

針刺；機械力刺激；成纖維細胞；細胞骨架；絲裂原活化蛋白激酶

隨著實驗針灸學的發展和進步，穴位實質和針灸治療機理的研究逐漸得到醫學界的重視，已從穴位組織、細胞、分子深入到基因水平。關于筋膜結締組織與針刺作用的相關研究也越來越受關注。穴區組織細胞在接受針刺作用后如何將機械刺激感知并轉換為生物信號的過程，已成為近年較熱門的研究方向。通過對針刺信號傳導機制的研究，能更科學充分地闡明針灸治療疾病的途徑與機制，促進針灸在臨床中的廣泛應用與傳承。針刺作用于穴位后，根據針刺部位和深度的不同可將接受刺激的部位分為真皮層致密結締組織、皮下疏松結締組織、肌間隔疏松結締組織、神經血管束疏松結締組織和器官門疏松結締組織，其中后4種類型均屬于非特異性結締組織范疇，即筋膜結締組織[1]。而成纖維細胞是疏松結締組織中數量最多的細胞，主要由胚胎時期的間充質細胞分化而來，具有合成和分泌膠原纖維、彈性纖維、網狀纖維及有機基質等功能。其對局部張力變化非常敏感，是主要的感受性細胞和效應性細胞。因此，成纖維細胞在針刺的力信號傳導中具有重要意義。

1 成纖維細胞形態改變與針刺作用的關系

細胞的形態結構是細胞功能代謝的物質基礎，細胞形態的改變影響著細胞功能代謝的完成。針刺作為一種外界的機械刺激，可被穴位中的成纖維細胞感知，并引起成纖維細胞形態、突起、周長及橫截面積等改變。通過針刺對穴位進行提插捻轉時，組織位移可發生顯著變化，尤其在捻轉針體時組織位移可被擴大5倍[2]。這種組織牽拉導致了成纖維細胞在周長和橫截面積方面發生顯著時間、依賴性增長，牽拉組織中的成纖維細胞突起更短，“片狀”細胞體積更大[3]。在激光共聚焦顯微鏡下，30%成纖維細胞的突起從一個細胞到另一個細胞是連續的[4]。同時，雙向捻轉針刺手法可引起成纖維細胞出現廣泛的細胞擴展，形成大量板狀偽足，在捻轉兩圈時該效應最明顯，此時的針刺效應可被Rho激酶抑制劑和肌動球蛋白收縮等阻斷[5]。通過針刺捻轉手法刺激穴位時，針體對膠原纖維的牽拉可能引起針體周圍大量成纖維細胞的可逆性收縮。該種收縮又可進一步牽拉膠原纖維，進而導致基質變形的“波浪”式傳導，最終細胞收縮將針體機械力信號傳導到整個結締組織[6]。疏松結締組織遍布全身，在體內形成一個連續的網絡,包括皮下和周圍間質結締組織及滲透到肌肉和器官的結締組織[7]，這可能是針刺循經感傳的一種理論支撐。

成纖維細胞作為穴區主要的感受性細胞，對機械力刺激的感應非常敏感。筋膜組織成纖維細胞在受到壓力刺激時，細胞形態由原來的梭形變為三角形，原本分布均勻的成纖維細胞間隙加大，細胞發生回縮，細胞形態縮小[8]。人牙周成纖維細胞在機械拉伸應變作用下，細胞形態和骨架均發生規律變化，細胞和細胞核投影面積與加壓時間及應變值均呈正比[9]。骶韌帶成纖維細胞在受到拉伸力加載后，結果顯示加力前細胞形態多為長梭形或不規則三角形，排列呈多向性，無明顯規律，隨受力時間延長，形態成了單一的長梭形，排列方向趨于規則并垂直與最大應變方向，以加力24 h最明顯[10]。而針灸的刺法，從微觀角度分析其力學刺激主要表現為針體機械運動過程中針體與周圍組織間的擠壓力、摩擦力和牽張力作用[11]，由此推斷，作為機械力刺激的一種，針刺作用亦能使穴區成纖維細胞發生相同的效應，為日后的研究提供了新的方向和思路。同時有研究發現，針刺引起成纖維細胞變形，進而影響撕裂原活化蛋白激酶(MAPKs)等信號蛋白的表達，激發體內一系列生物效應[12]。可見，成纖維細胞在感受針刺等機械刺激及針刺信號傳遞中發揮著重要作用，預示了針刺的牽拉力和壓力在結締組織中傳導的形式。

2 成纖維細胞骨架對針刺等機械刺激的響應

細胞骨架是一組由纖維狀結構組成的，位于細胞漿和細胞核內的一類復雜的蛋白質纖維網狀結構，廣義的細胞骨架包括細胞外機制、細胞膜骨架、細胞質骨架和細胞核骨架，狹義的細胞骨架主要指細胞質骨架，分為微絲、微管、中等纖維以及微梁等結構。其功能為維系細胞體積和形態，參與細胞的力傳導、胞內物質運輸、細胞分裂和運動等，其表面含有大量負電荷，能結合多種機械敏感分子，并能調節受體介導信號分子傳導和離子通道的運輸。

針刺作為一種機械刺激，能對穴區組織產生擠壓力、摩擦力和牽張力，這些力分別作用于細胞后，大部分是由微絲中的F-actin肌動蛋白骨架來相應。F-actin作為骨架微絲蛋白的主要成分，對細胞黏附、鋪展、運動和內吞及分裂等具有重要作用[13]，因其與跨膜分子相連而成為跨膜信號傳遞的主要環節[14]。當F-actin受到非破壞性壓力刺激時，會發生纖維解聚，纖維變細、變短，排列不一致，在加力12 h時有所恢復，破壞性壓力刺激下F-actin解聚，微絲形態隨加力時間延長而遭到不可逆破壞[15]。微絲中的肌動蛋白是決定細胞形態的最重要骨架蛋白，它通過與肌動蛋白集合蛋白發生反應以接受來自細胞外的刺激并做出應答，而α-輔肌動蛋白作為細胞骨架中重要的肌動蛋白結合蛋白，能使肌動蛋白絲和肌動蛋白束及肌動蛋白網架發生交聯，使細胞骨架微絲進一步形成，在適應性力作用下α-輔肌動蛋白合成可持續增加[10]。

3 成纖維細胞整合素對機械刺激的響應

整合素主要由α、β 2個亞單位組成，是一類介導細胞-基質和細胞-細胞黏連的細胞表面受體。生物細胞力學研究表明，細胞外機制-整合素-細胞骨架是細胞力學信號傳導的經典途徑[16]。整合素作為跨膜蛋白在該信號通路中起到關鍵的“信號中轉站”作用，主要介導細胞之間、細胞與細胞外基質之間的相互黏附，以及介導力學信號在細胞內外之間的雙向傳導[17]。壓力是經絡腧穴的有效刺激手段之一，壓力刺激能促進筋膜成纖維細胞力感受器整合素分子α1亞基、α3亞基以及β1亞基的表達，筋膜成纖維細胞可通過β1亞基感受壓力學刺激。研究發現，整合素β1對低中度強度的壓力刺激強表達，對重度壓力的刺激弱表達[18-19]，目前認為細胞骨架與信號分子結合部位主要是整合素β，α亞基只起調節作用。β亞基在機械力刺激作用下，其“膝部”彎曲以暴露基質結合位點，可活化細胞內的黏著斑和RhoGTP酶，調節細胞骨架構的構象及活化信號通路[20]。跨膜細胞黏附分子整合素是大多數細胞共有的、關鍵的力感受器分子，外界刺激可使其發生空間分子內應力變化，誘導某種活性結構或功能域的形成，促發生物化學級聯反應，以完成力信號向生物化學信號的轉化[21-22]。因此，整合素對機械刺激的這種響應是否能夠由針刺作用激發，并以此揭示針刺的力信號在細胞中傳遞的機制，還有待進一步的研究來證實。

4 MAPK信號傳導通路與細胞骨架的關聯性

絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號通路是介導細胞力信號傳導的重要途徑，可被一些生長因子、細胞因子、炎癥、滲透壓改變及DNA損傷劑等激活。常見MAPK信號通路有細胞外信號調節激酶(ERK1/2)、C-Jun氨基末端激酶1/2/3(JNK1/2/3)、p38MAPK(p38 α,β,γ,δ)及ERK5、ERK7/8和ERK3/4[23]。這些信號通路能同時對微管、微絲和中間纖維等進行調節。對微管的調節主要有MAPK信號通路能使MAPs過度磷酸化而間接調節微管的穩定性，其中p38MAPK激酶可通過使鈣離子結合蛋白中MAP14(S100A9)過度磷酸化來抑制MRP8/MRP14復合物引起微管多聚化[24]。MAPK對微絲的調節表現在：被激活的ERK、JNK和p38MAPK通路可引起微絲發生重排及細胞形態改變，其中p38MAPK和ERK通路還參與了微絲重排時細胞的遷移能力。而p38MAPK還能夠通過影響微絲的完整性和穩定性調節細胞的凋亡和再分化[25-26]。MAPK信號通道對中間纖維的調節主要有：p38MAPK可通過影響角蛋白的磷酸化狀態及其在胞內的聚合來調節細胞的形狀[27]。同時p38MAPK/MK2通路還可促使小熱休克蛋白家族中的Alpha B-crystallin蛋白磷酸化，從而調節中間纖維的穩定性[28]。研究發現，p38MAPK和JNK通過激活HSP27蛋白而增強細胞骨架的穩定性[29]。針刺可通過抑制皮膚組織p38MAPK和NF-kB的表達來降低MMP-1的生成，阻止細胞外基質成分降解而起到抗皮膚衰老的作用[30]。同時針刺作用能促進筋膜組織和脊髓節段中ERK1/2與p38MAPK的表達，這不僅說明針刺作用能激活MAPK通道，同時從側面證實了針灸對人體的作用不僅能通過神經-體液調節，還可能存在一種較為原始的調控網絡，即筋膜結締組織支架可能在微觀信號傳遞層面對局部細胞分化與增殖有著促進作用[11]。

5 其他

此外，針刺作用還可對成纖維細胞相關生長因子進行調節。陳波等[31-32]通過模擬毫針壓力刺激作用對體外培養的大鼠“足三里”穴筋膜組織成纖維細胞施壓后，結果表明壓力刺激能調節筋膜組織成纖維細胞基質金屬蛋白酶1(MMP-1)、基質金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP1)和前列腺素E2(PGE2)的合成與釋放，并能提高MMP-1與TIMP1的比值。同時在200kPa壓力刺激時，成纖維細胞干擾素-β(INF-β)含量顯著降低，而腫瘤壞死因子(TNF-α)合成釋放量明顯增高。由此推斷，毫針的機械刺激作用可能是通過調節穴區成纖維細胞相關生長因子的表達來轉換成生物信號的。同時，通過電針刺激創傷大鼠創面尤其是負極在傷口正中時，能加速創面成纖維細胞及角化細胞生長因子的形成，從而促進傷口的快速愈合[33]。間歇性機械牽張力能促進人牙周膜成纖維細胞增殖，在1000ustrain和2000ustrain時表現明顯[34]，而12%形變率、0.2 Hz頻率的牽張力對人牙周膜成纖維細胞增值效果最佳[35]。

綜上所述，當壓力、牽張力等力學刺激作用于穴區后，可能通過影響成纖維細胞的數量、形態結構，改變成纖維細胞骨架中微絲的形態，促進成纖維細胞整合素及相關生長因子的表達，調節MAPK信號傳導通路中的JNK、p38MAPK及ERK等信號通道，來實現機械力信號向生物化學信號的傳導。提示成纖維細胞在力效應傳導的過程中起著重要作用，尤其是細胞骨架作為連接介質，其發生改變是機械力信號傳導的重要環節之一。由此推測，針刺作用屬于力學刺激的一種，同樣能通過以上方式將刺激作用轉換為生物化學信號，傳至全身起到治病救人的效果。但目前的研究多以理論推斷和科學印證為主，其中又以模擬針刺力刺激的研究居多，如何通過對針刺力信號傳導機制的進一步深入研究，揭示力信號在成纖維細胞中的傳導規律，更全面地揭示針刺效應的產生與成纖維細胞骨架、MAPK信號通路及相關生長因子等之間的關系和機制，是未來研究中需要面對和克服的問題，這對于針灸臨床效應的提高有著不容忽視的重要性。

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Effect of Fibroblasts Stimulated by Acupuncture and Mechanical Stress

ZHANG Xiao-hong, CAI Ding-jun△, Wang-Yu, HUANG Shi-qi

(ChengduUniversityoftraditionalchinesemedicine,chengdu610000,sichuan,china)

As the main receptor and effector cell of acupoint, the fibroblasts which stimulated by acupunture and some mechanical force will change in cellular forms,perimeter and cross-sectional area regularly. Acupuncture action is a kind of mechanical force，and the mechanical Strains can promote fibroblasts proliferation, compound and release some growth factors,even refactor cytoskeleton. This series of changes may be associated to the mechanical effect, and the integrin and MAPK signal transduction pathway of the fibroblasts can be actived by mechanical force.Thereby, this process results in mechanical force transform to biological chemical signals.It can be concluded that the change of the fibroblastse has important research significance in acupunture force signal transfer pathway.

Acupunture; Mechanical Strain; Fibroblasts; Cytoskeleton; MAPK

國家自然科學基金資助項目(81373559)-經穴反應性時間特征的嘌呤信號—成纖維細胞

張小紅(1989-)，女，四川遂寧人，醫學碩士，從事針灸時間效應及其機制的研究。

△通訊作者：蔡定均(1975-)，女，教授，碩士研究生導師，從事針灸時間效應及其機制的研究，Tel:13558620019,E-mail:1325581717@qq.com。

R224.1

A

1006-3250(2017)03-0380-04

2016-08-10