熟地寄生壯骨方對大鼠創傷性骨關節炎模型抗炎及保護軟骨作用的實驗研究*

林潔華,周穎燕,徐偵雄,何曉紅,陳更新,陳玉興, 趙自明, 何羿婷△

(1. 廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣州 510120；2. 廣東省中醫院風濕科，廣州 510120；3. 廣東省中醫院新藥開發辦，廣州 510120；4.廣東省中醫藥科學院，廣州 510120)

熟地寄生壯骨方對大鼠創傷性骨關節炎模型抗炎及保護軟骨作用的實驗研究*

林潔華1,周穎燕1,徐偵雄2,何曉紅2,陳更新3,陳玉興4, 趙自明4, 何羿婷3△

(1. 廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣州 510120；2. 廣東省中醫院風濕科，廣州 510120；3. 廣東省中醫院新藥開發辦，廣州 510120；4.廣東省中醫藥科學院，廣州 510120)

目的：觀察熟地寄生壯骨方對大鼠創傷性骨關節炎模型的影響，探討其抗炎及保護軟骨作用。方法：采用創傷性膝骨關節炎大鼠模型，切取病變膝關節制備膝關節勻漿液，測定給藥前后一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子-a(TNF-a)的含量；病變膝關節組織病理切片，按Mankin骨關節炎組織分類法進行評分。結果：與空白組比較, 模型組大鼠膝關節NO、TNF-α含量顯著增大，大鼠膝骨關節Mankin評分值顯著增大；與模型組比較, 熟地寄生壯骨方各組NO、TNF-α含量均明顯減小，大鼠膝骨關節Mankin評分值均明顯減小。結論：熟地寄生壯骨方能降低創傷性骨關節炎模型大鼠膝關節NO、TNF-α含量及改善其軟骨形態，達到控制炎癥及保護軟骨的目的。

創傷性膝骨關節炎；模型；熟地寄生壯骨方；抗炎；軟骨形態

創傷性骨關節炎(Post-traumatic osteoarthritis) 是骨關節炎的常見類型之一[1]，是由創傷引起的以關節軟骨退化變性和繼發軟骨增生、骨化為主要病理變化，以關節疼痛、活動功能障礙為主要臨床表現的一種疾病[2]。近年來, 隨著外傷、交通事故的增多，關節軟骨的損傷概率增大，創傷性骨關節炎的發病率有增加趨勢[3]。至今人們對軟骨損傷后的自然演變過程還不夠了解，創傷性骨關節炎的發病機制仍不清楚[4]。

中醫學認為創傷性骨關節炎屬于“氣滯血瘀”“風寒濕痹阻”痹癥范疇。熟地寄生壯骨方以祛瘀通絡、補益肝腎、益氣養血、祛風除濕為法，扶正驅邪、補中寓通使氣血合而筋骨通，肝腎強而痹痛愈，臨床應用多年療效確切。本研究以觀察熟地寄生壯骨方對創傷性膝骨關節炎模型大鼠的影響為目的，進一步尋求熟地寄生壯骨方治療創傷性膝骨關節炎的實驗證據。

1 材料

1.1 藥物

熟地寄生壯骨方提取物(熟地、桑寄生、骨碎補、蘇木、海風藤)由廣東省中醫研究所制劑研究室提供。使用時按劑量以蒸餾水配制成所需濃度，4℃冰箱保存。必理通(對乙酰氨基酚片)，中美天津史克制藥有限公司(批號11012605)；壯骨關節丸，三九醫藥股份有限公司(批號1103111S)。

1.2 試劑

甲醛，廣州化學試劑廠(批號20120811-1)；一氧化氮(NO)試劑盒,南京建成生物工程研究所提供(批號20130614)；TNF-α ELISA試劑盒，上海西唐生物科技有限公司(批號20130103)；無水乙醇，天津化學試劑科貿公司(批號20120714)。

1.3 儀器

JJ3000動物電子秤，G&G公司產品；BS224S電子天平(1/萬)，德國SARTORIUS產品；YD62 型石蠟包埋機，浙江金華益迪產品；Leica RM2235輪式切片機，德國萊卡公司產品；Leica TP 1020型全自動脫水機，德國萊卡公司產品；YD-AB型攤烘烤片機，浙江金華益迪產品；YD-6L型智能冰凍包埋機，浙江金華益迪產品；Shandon Gemini染色機，德國Thermo公司產品；DHG-9203型電熱恒溫干燥鼓風干燥箱，上海精密實驗設備廠產品；Olympus DP2-BSW型病理圖像采集系統，日本奧林巴斯公司產品。

1.4 動物

SPF級SD大鼠雌雄各半，體質量180～220 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供(動物生產許可證號SCXK(粵)2008-0002，實驗動物質量合格證號№44007200002932)。動物實驗環境:廣東省中醫研究所SPF級動物實驗室(設施使用許可證號SYXK(粵)2010-0059)。

2 方法

2.1 動物分組

取SPF級SD大鼠70只雌雄各半，按體質量隨機分為空白對照組、模型對照組、必理通片組、壯骨關節丸組、熟地寄生壯骨方高、中、低劑量組7組。

2.2 劑量設置

參考《中藥藥理研究方法學》中劑量換算方法“體表面積比”換算動物臨床等效劑量，并以此作為大鼠藥效學實驗劑量。必理通片大鼠藥效學實驗劑量為0.270 g/kg，壯骨關節丸大鼠藥效學實驗劑量為1.080 g/kg，熟地寄生壯骨方處方量為155 g生藥，等效劑量為13.950 g/kg，考慮給藥濃度和給藥體積，設計熟地寄生壯骨方大鼠藥效學高劑量為27.900 g/kg，中劑量為13.950 g/kg，低劑量為6.975 g/kg(分別為2倍臨床等效劑量、臨床等效劑量、1/2臨床等效劑量)。實驗時以蒸餾水按劑量配制成所需濃度，4℃冰箱保存。

2.3 統計學方法

2.4 給藥方法

熟地寄生壯骨方各劑量組及陽性對照藥按劑量灌胃給藥，給藥體積10 ml/kg，每天1次，對照組同法灌胃給予蒸餾水10 ml/kg。

2.5 測定方法

除正常對照組大鼠外，其余各組大鼠均采用切除內側副韌帶和內側半月板法(膝內關節炎經典動物模型-Hulth 模型)復制大鼠創傷性膝骨節炎模型，正常對照組切開后不切除內側副韌帶和內側半月板，術后連續3 d青霉素20萬U肌肉注射,1周后各給藥組開始給藥，正常對照組、模型對照組給予等體積蒸餾水，每天1次，連續8周。末次給藥后1 h處死大鼠，取同部位病變膝關節，大體觀察后小心切取小塊同部位病變膝關節，仔細去除骨頭和皮膚稱重，在冰浴下以電動研磨器制作 20 %勻漿液，2000 r/min 離心 10 min取上清液，采用 ELISA 法測定NO、TNF-a含量。取同部位病變膝關節組織常規固定、脫鈣、包埋、封片、染色，光鏡觀察后按Mankin骨關節炎組織分類法進行評分。

3 結果

3.1 熟地寄生壯骨方對創傷性膝骨關節炎大鼠膝骨關節NO、TNF-α含量的影響

表1顯示，與空白對照組比較, 模型對照組大鼠膝骨關節NO、TNF-α含量顯著增大(P<0.01)；與模型對照組比較, 熟地寄生壯骨方高、中、低劑量組大鼠膝骨關節NO、TNF-α含量均明顯減小(P<0.01)。

3.2 熟地寄生壯骨方對創傷性膝骨關節炎大鼠膝骨關節Mankin評分的影響

表1顯示，與空白對照組比較, 模型對照組大鼠膝骨關節Mankin評分值顯著增大(P<0.01)；與模型對照組比較, 熟地寄生壯骨方高、中、低劑量組大鼠膝骨關節Mankin評分值均明顯減小(P<0.01)。

3.3 熟地寄生壯骨方對創傷性膝骨關節炎大鼠膝骨關節組織病理學的影響

空白對照組大鼠關節軟骨表面光滑,4層結構清晰可辨,軟骨細胞排列整齊呈柱狀,潮線完整,染色質分布均勻,細胞核清晰,深染均勻(圖a)。

模型對照組大鼠關節軟骨層變薄、粗糙,結構不易分辨,部分區域軟骨細胞核固縮、壞死,偏于一側,鈣化層軟骨細胞呈簇狀,軟骨細胞排列紊亂,潮線多不完整或完全消失,甚至軟骨下骨質外露、軟骨下骨囊變的形成(圖b)。

表1 對創傷性膝骨關節炎大鼠膝骨關節NO、TNF-α含量及Mankin評分的影響±s)

注：與正常對照組比較：**P<0.01；與模型對照組比較：##P<0.01

熟地寄生壯骨方高、中、低劑量和陽性藥必理通片、壯骨關節丸等治療組在病變發生率、病變范圍和病變嚴重程度方面與模型組比較均有降低或減輕，膝關節軟骨組織在變性、簇聚和壞死方面均輕于模型組(圖c-g)。

圖1 各組大鼠膝關節病理形態比較(HE 染色 ×400)

3 討論

Hulth 法模型為膝內關節炎經典動物模型[5]，主要方法是麻醉后將動物膝關節前后交叉韌帶及內側副韌帶切斷，切除內側半月板，術中避免損傷關節軟骨，術后不固定傷肢，動物可自由活動，此方法借手術形成關節不穩從而誘發骨關節炎。半月板切除后會導致關節的不合槽運動，由于動物膝關節的正常力學軸線遭破壞，關節最大壓力承受面由正常的外側脛骨平臺轉至內側脛骨平臺與股骨內髁，加之韌帶的破壞引起關節不穩定，局部關節軟骨所承受的壓力相對增加，從而促使關節軟骨發生變性[6]。Hulth 法模型誘導成功率高，穩定性好，應用廣泛，特別適用于膝關節內注射藥物預防和減輕軟骨病理改變的研究[7]。Welch等[8]發現，單純切除內側半月板前角的大鼠膝關節在6周內無明顯改變，12 周后關節評分有顯著改變；而同時內側半月板部分切除模型中，6 周時即發現關節評分顯著增加。本研究通過切除內側副韌帶和內側半月板法復制大鼠創傷性膝骨節炎大鼠模型，造模后模型組膝骨關節NO、TNF-α含量及Mankin評分值顯著增大，且各給藥組與模型對照組比較，給藥前膝骨關節NO、TNF-α含量及Mankin評分值均無明顯差異，提示Hulth 法創傷性膝骨關節炎大鼠模型造模成功。

腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是機體免疫系統調節骨代謝的主要因子，是參與OA 發病進程中的重要介質[9]。另外，TNF-α能激活IL-6基因，誘導IL-6生成，產生進一步的炎癥反應；又有學者報道， TNF-α主要影響滑膜炎癥和免疫學反應，能誘發抗自身軟骨的自身免疫反應[10]。還有研究表明，TNF-α是主要的炎性細胞因子，已有報道OA患者的滑膜內存在著高濃度的TNF-α，TNF-α能激活多型核細胞，刺激滑膜細胞產生前列腺素E2，促進軟骨基質金屬蛋白酶合成和分泌，引起關節軟骨吸收、降解和破壞[11]。熟地寄生壯骨方可以明顯減少膝骨關節TNF-α含量，從而達到抗炎、保護軟骨的作用，起到治療創傷性膝骨關節炎的作用。

一氧化氮與骨關節炎的發病機制密切相關[12-13]。正常情況下, 一氧化氮起宿主防疫作用, 但過量的一氧化氮可導致各種慢性炎癥[14],增高的一氧化氮可協同各種細胞因子作用于關節軟骨[15]。在關節炎時兩者相互協同作用, 使病情加重, 阻斷這一惡性循環的過程可以減輕關節軟骨的損傷, 減輕病情。多項研究表明, 創傷性軟骨退變與細胞凋亡密切相關。Hashimoto等[16]研究認為, NO 可能介導創傷后軟骨細胞的凋亡。熟地寄生壯骨方可以明顯地降低膝關節一氧化氮的含量，打破其惡性循環，從而保護關節軟骨。

中醫學認為創傷性骨關節炎屬于痹癥范疇， “氣滯血瘀”“風寒濕痹阻”證為多見，病機為腎氣不足、風寒濕邪侵入骨骼，或跌仆閃挫，傷損骨骼，以致氣血瘀滯，運行失暢，筋骨失養，久之肌萎筋縮、骨節凝滯。熟地寄生壯骨方以祛瘀通絡、補益肝腎、益氣養血、祛風除濕為法，扶正驅邪，補中寓通，使氣血足而筋骨通，肝腎強而痹痛愈，針對創傷性骨關節炎病因病機，臨床應用多年療效確切。

本研究在創傷性膝骨關節炎大鼠模型造模成功的基礎上，探討熟地寄生壯骨方對創傷性膝骨關節炎的治療作用。研究結果提示，熟地寄生壯骨方明顯降低大鼠膝骨關節NO、TNF-α含量，還可減輕模型組軟骨病變發生率、病變范圍和病變嚴重程度，改善軟骨組織的變性、簇聚和壞死病變。Mankin評分亦說明，熟地寄生壯骨方可改善創傷性膝骨關節炎模型大鼠的軟骨病理損害，并證實熟地寄生壯骨方有抗炎及改善軟骨退變、保護軟骨的作用，為臨床治療創傷性膝骨關節炎提供了有力的實驗依據。

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Effects of Shudi Jisheng Zhuanggu Decoction on anti-inflammatory and Morphology of Articular Cartilage of Knee Post-traumatic Osteoarthritis Model Rats

LIN Jie-hua1, ZHOU Ying-yan1, XU Zhen-xiong2, HE Xiao-hong2, CHEN Geng-xin3, CHEN Yu-xing4, ZHAO Zi-ming4, HE Yi-ting3△

(1.TheSecondClinicalMedicalCollegeofGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510405,China; 2.Dept.ofRheumatism,GuangdongProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510120,China; 3.Dept.ofNewDrugDevelopment,GuangdongProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicineGuangzhou510120,China; 4.GuangdongProvincialAcademyofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510120，China)

Objective: To observe the anti-inflammatory effect and the morphology change of articular cartilage under intervention of Shudi Jisheng Zhuanggu decoction (SJZ) in knee post-traumatic osteoarthritis model rats. Methods: Rats were removed the medial collateral ligament and the medial meniscus to build models of knee post-traumatic osteoarthritis(Hulth’s modeling method)before administration of drugs. Prepared 20% homogenization buffer of the knees to measure the contents of nitric oxide (NO) and TNF-α.Histologic sections of cartilage were received HE staining and Gemini staining were evaluated according to Mankin cartilage histological score. Results: Mankin score and the contents of NO and TNF-α were significantly increased in model group compared to control group. Mankin score and contents of NO and TNF-α of SJZ groups were significantly decreased compared to model group. Conclusion: SJZ can control inflammation and ameliorate morphology of articular cartilage in rats with knee Post-traumatic osteoarthritis, so as to protect the cartilage and delay cartilage degeneration.

Knee post-traumatic osteoarthritis; Model; Shudi Jisheng Zhuanggu decoction; Anti-inflammation； Morphology of cartilage

廣東省科學技術廳—廣東省中醫藥科學院聯合科研專項(2011B032200016)-熟地寄生壯骨方治療膝骨性關節炎的組方優化研究

林潔華(1990-)，女，廣東揭陽人，醫學博士，從事中醫藥風濕病的臨床與實驗研究。

△通訊作者：何羿婷，主任醫師，醫學博士，博士研究生導師，從事中醫藥風濕病的臨床與實驗研究，Tel：020-81887233-39402，E-mail：yitinghe@126.com。

R285.5

B

1006-3250(2017)03-0411-04

2016-09-15