非創傷性股骨頭壞死相關信號通路研究進展

付志斌 李盛華 周明旺 葉丙霖 郭鐵峰 吳獻毅

1. 甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000 2. 甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050

近年來，隨著醫學科技的不斷進步，對于信號通路的研究也越來越深入，發現信號通路與人體多種代謝性疾病的發病具有相關性，骨代謝性疾病與信號通路的研究也取得了一定的成果。非創傷性股骨頭壞死(nontraumatic osteonecrosis of femoral head，NONFH)是骨代謝性疾病中的的代表性疾病之一，也是目前醫學水平不能完全治愈的疾病之一，故通過信號通路的調控作用的研究，證實或揭示NONFH發病的病因病機和找到NONFH治療的新方法、新途徑，成了許多研究的焦點，大量的研究證實許多信號通路的調控作用在NONFH的發生、發展過程中具有一定的相關性，本文就圍繞NONFH相關的信號通路研究進展予以綜述。

1 Wnt信號通路

Wnt信號通路是目前研究發現，機體中的一條相對保守的信號通路，在細胞增殖和生長過程具有重要的調控作用，也對多種骨細胞增殖分化均具有一定的調控作用。其主要成員包括：細胞外因子(Wnt)、胞質蛋白(β-catenin)、卷曲蛋白(Frizzled)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、及核內轉錄因子(T cell factor,TCF)等。

1.1 β-catenin

Wnt/β-catenin信號通路目前被認為是Wnt信號通路轉導中的經典通路，Neth等[1]研究發現Wnt信號通路是人骨髓間充質干細胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hMSCs)增殖、遷移和侵襲功能調控的關鍵因子。Weng等在NONFH的實驗研究中發現[2-3]髓基質細胞(MSCs)具有向脂肪細胞分化的能力，并且可以使脂肪細胞增殖、肥大，造成脂肪細胞的堆積，導致股骨頭內壓力升高，血液循環障礙，股骨頭內骨的重建和塑型功能停滯或完全抑制，壞死的骨組織不能被及時修復，最終導致股骨頭壞死的發生(osteonecrosis of femoral head,ONFH)。由于經典Wnt通路的在人體內信號的傳導是，通過激活β-catenin而發揮作用，故經典Wnt信號通路又稱為Wnt/β-catenin信號通路。許多研究證實Wnt/β-catenin信號通路在MSCs表達中具有關鍵性作用，所以在NONFH的相關信號通路的研究中Wnt/β-catenin通路是研究最多，Wnt/β-catenin信號分子的受體是Frizzled及LRP5/6。β-catenin在這條信號通路有著重要的作用，同時也是脂肪間充質干細胞成脂分化過程中重要的調控因子[4]；Wnt/β-catenin信號通路在骨細胞的增殖、分化中的調節作用具有多樣性，能夠促進MSCs的更新，促進成骨分化，抑制成脂，并受BMP-2的調節[5-7]。

卓金偉[8]用醋酸潑尼松龍造模的兔激素性股骨頭壞死模型發現發病組中β-catenin和LRP5在的相對表達量較未發病組與對照組減少，表明Wnt/β-catenin信號通路受到抑制可能是發病組表達減少的主要因素；且由該研究結果可推測過量的糖皮質激素可能抑制Wnt/β-catenin信號通路的成骨作用，反而提高股骨頭中成脂能力，誘發股骨頭骨細胞凋亡，最終導致股骨頭缺血壞死的發生。張晨等[9]大鼠激素性股骨頭缺血性壞死(steroid-induced avascular necrosis of femoral head,SANFH)模型研究發現，分泌型卷曲相關蛋白1(secreted frizzled-related protein 1,SFRP1)可抑制Wnt/β-catenin信號通路的作用，增加股骨頭壞死的發生幾率。

1.2 DKK-1

DKK-1(Dickkopf-1)是DKKs(Dickkopfs)家族中的一員，在脊椎動物中包括Dkk-1、Dkk-2、Dkk-3、Dkk-4；其成員都是分泌型糖蛋白，Wnt信號在細胞內的傳遞作用可被DKK-1與其相應的受體結合后抑制，影響細胞的增殖、分化及遷徙等許多方面。DKK-1對Wnt信號通路正常傳導起負調節作用，是Wnt信號傳導調控抑制劑，可抑制Wnt糖蛋白與受體卷曲蛋白(Frizzel)和低密度脂蛋白相關受體蛋白(low density lipoprotein receptor-reatein protein，LRP)協同受體結合形成復合物，破壞Wnt信號正常傳導、抑制其生物調節功能[10-13]。

大量的學者對SANFH研究證實，在SANFH發生發展過程中，激素可上調DKK-1的表達，進而阻斷MSCs向成骨細胞(osteoblast,OB)分化，并誘導成骨細胞凋亡，激活破骨細胞(osteoclast,OC)，導致成骨能力及骨修復能力下降及骨量丟失，最終發生股骨頭壞死[14-18]。臺灣學者[19]通過檢測39名股骨頭壞死患者與10名正常人血清中DDK-1含量，發現股骨頭壞死患者血清中DDK-1含量明顯高于正常人，對于不同的壞死分期股骨頭壞死患者，DDK-1含量與股骨頭壞死分期呈正相關，中晚期患者血清中DDK-1含量明顯高于患者早期患者。

2 OPG/RANKL/RANK

OPG/RANKL/RANK信號通路系統是1997年發現的一組調控破骨細胞分化激活的細胞因子，其三者均屬腫瘤壞死因子受體超家族(tumomecrosisfactor receptor superfamily,TNFRSF)，骨保護素(osteoprotegerin,OPG)屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族，主要的作用機理是由成骨細胞前體和間質細胞產生一種分泌型糖蛋白，誘導受體與核因子KB受體活化因子配體(receptoractivator of nuclear factoi-kappa B ligand,RANKL)發生競爭性結合，抑制RANKL與核因子KB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-kappaB，RANK)的相互作用，使破骨細胞前體被成骨細胞誘導分化和融合的作用受到抑制，達到調控破骨細胞分化、增殖和凋亡的目的，并影響破骨細胞生理功能。

經典Wnt信號通路通過OPG/RANKL在成骨細胞內的表達而抑制破骨細胞分化[20-22]，OPG通過與RANK競爭其配基RANKL，RANKL/RANK的結合被阻斷而破骨信號通路，有效降低破骨細胞的活性，抑制破骨細胞的作用而減少骨質的丟失。王巖[23]用脂多糖聯合甲基強的松龍建立動物模型，對動物標本形態學發現，模型組股骨頭局部OPG/RANKL染色率低，骨密度值低于空白組。Schaffler研究證實[24]：糖皮質激素給藥干預可使股骨頭局部OPG表達明顯降低，其表達降低程度與給藥時間的長短呈正相關，且發現股骨頭局部破骨細胞增多，骨吸收能力增強，骨小梁結構變的纖細、紊亂，而外源性OPG介入對這一病理進程有保護作用。

3 TLR4信號通路

TLR4信號通路根據對MyD88依賴型可分為依賴型和非依賴型兩種。MyD88在依賴型的TLR4信號通路中可介導下游NF-κB的激活，同時NF-κB也可通過募集MyD88等相關因子進行相應信號轉導[25]，并且聯合其他相關因子共同參與破骨細胞的活化過程。在破骨前體細胞分化成熟和破骨細胞增殖過程中，NF-κB參與的的相關信號通路發揮最主要作用。此外，NF-κB還可激活MCP-1，誘導單核/巨噬細胞系分化，產生大量的破骨細胞。田雷等[26]發現，激素類藥物可以誘導TLR4信號通路的過度激活，引起一種免疫級聯效應，使大量破骨細胞活化增殖，引起骨質疏松，股骨頭抗壓能力減弱，脆性增加，最終造成股骨頭壞死。

4 HIF-1α信號通路

低氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是生物體內最具特征性的低氧反應信號通路。在機體缺血/缺氧環境下，骨形成和血管生成的偶聯過程中HIF-1α信號通路有著重要的調控作用。低氧的條件可以誘導HIF-1α入核與HIF-1β形成二聚體并募集共激活劑CBP/P300，反式作用于含有核苷酸序列為5'-G/ACGTG-3'的低氧反應元件(hypoxia response element;HRE)，進一步激活下游靶基因，改變一系列細胞的功能，包括能量代謝，紅細胞造血，血管發生，鐵代謝，自由基清除等，對缺氧的條件產生適應性反應。

Li等[27]在股骨頭缺血性壞死的組織標本內可找到HIF-1α的表達。Zhang 等[28]對股骨頭壞缺血性死動物模型的研究證實HIF-1α上調Sox9活性可對缺血性股骨頭壞死的軟骨代謝產生影響。HIF-1α的主要作用是能夠使軟骨細胞適應缺氧環境，是軟骨形成的主要介質之一，該蛋白缺失可導致生長板內部缺氧區域內的細胞大量死亡[29]，說明在軟骨細胞正常生長的過程中HIF-1α起著重要作用。其作用機制可能是HIF-1α激活其部分下游基因，使軟骨細胞的代謝轉向節氧途徑并激活軟骨無氧酵解，以適應缺氧環境[30]。以上研究證據說明HIF-1α信號通路在股骨頭缺血性壞死的發生過程有一定的關系。

5 RhoA/ROCK信號通路

近年來也有大量報道RhoA/ROCK信號通路在間充質干細胞成骨成脂分化過程中有著重要的調節作用。RhoA/ROCK信號通路可影響軟骨細胞的形態及功能，通過改變軟骨細胞骨架。Vogel等[31]的研宄也表明在PHD基因敲除的Hela細胞或使用PHI(prolyl hydroxylase inhibitors,PHI)對PHD活性抑制的Hela細胞能夠以不依賴于HIF蛋白的作用而激活RhoA/ROCK信號通路。

許多學者研究發現[32-35]，人工合成成骨生長肽(osteogenic growth peptide ,OGP)、機械應力、結締組織生長因子、細胞外基質的可塑性等因素能夠影響間充質干細胞的成骨分化和類肌腱細胞分化，其共同的作用機制是通過激活RhoA/ROCK信號通路促進成骨分化效應進而改變細胞的骨架結構而實現。Wang等[36]研宄也發現骨形態發生蛋白(BMP)是通過激活RhoA/ROCK信號通路通路，細胞骨架的改變而使細胞更能伸展的生長，進而促進細胞的成骨分化。

實驗發現[37]二甲基乙二酰基甘氧酸(dimethyloxalylglycine,DMOG)能明顯上調RUNX2及Osterix等與成骨分化相關的基因表達，促進BMSCs成骨分化。實驗還表明DMOG能明顯上調BMSCs成骨分化中RhoA/ROCK信號通路中關鍵分子total-RhoA、active-RhoA、ROCK1及p-cofilin的表達，最終抑制細胞肌動蛋白解聚，從而也降低了細胞的遷移能力。表明DMOG激活RhoA/ROCK信號通路可能是DMOG促進BMSCs成骨分化的重要分子機制。還證實經髓芯減壓植入DMOG/BMSCs/生物蛋白膠三者復合物，對激素性股骨頭壞死兔股骨頭局部有修復作用。股骨頭局部成骨與成血管相關蛋白RUNX2與VEGF表達明顯上調，表明DMOG在激素性股骨頭壞死的修復中發揮了重要重用。

6 MAPK信號通路

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen- activatedprotein kinase,MAPK)是廣泛存在于哺乳動物內的一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，其可被一系列如物理應激、生長因子、炎性細胞因子、細菌復合物等的細胞外信號或刺激所激活。MAPKs信號通路調節特定的基因表達是通過保守的三級酶促級聯反應(MAPKKK-MAPKK-MAPK)，激活細胞內相應的轉錄因子，參與細胞分化、增殖、轉化和凋亡等生理過程，是胞外信號引起細胞核反應的共同通路。MAPK通路是生物體內參與介導細胞分裂、分化、生長和發育等多種生理及病理過程的重要信號轉導系統之一。MAPK信號轉導是以三級激酶級聯的方式進行的，首先絲分裂原刺激磷酸化激活MAPKKK，MAPKKK轉而磷酸化激活MAPKK，最后由MAPKK磷酸化MAPK，使MAPK活化而轉入核內。

研究表明[38-42]，在MAPK信號通路中細胞外信號調節蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase,ERK)、P38和c-jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)參與成骨細胞增殖、分化和凋亡的信號轉導，并在骨質代謝和炎癥反應中具有重要作用，在BMSCs的成骨分化過程中也起著關鍵作用。齊振熙[43]在兔股骨頭髓內及離體兔BMSCs增殖實驗研究中發現，羥基紅花黃色素A(HSYA)可通過激活MAPK信號轉導通路，上調通路中與增殖關聯的p-ERK蛋白的表達，促進BMSCs增殖，下調凋亡相關聯的p-JNK、p-P38蛋白的表達，抑制其凋亡，減輕激素誘導對BMSCs凋亡的影響。

7 其它

有研究發現[44]RhoA參與關節軟骨內力學信號的傳導，RhoA/ROCK信號通路在關節軟骨的退變中具有重要的作用。更有學者發現[45-46]，VEGF信號通路在血管新生的過程中具有重要的調節作用，通過抑制VEGF信號通路，可抑制新生血管的發生，而缺血這一是股骨頭壞死的主要病理過程。

譚振等[47]通過雷奈酸鍶干預激素性Wistar大鼠模型研究發現，雷奈酸鍶可通過抑制模型大鼠股骨頭內DKK-1 過表達，激活Wnt信號通路，促進成骨分化及成骨活性，對股骨頭壞死起到早期的預防具有一定作用。李建新[48]研究發現，補腎活血湯調控BMSCs成骨-成脂分化的機制主要是通過增強化Wnt/β-catenin信號通路中成骨因子化的基因和蛋白表達，同時抑制成脂因子DDK1、SFRP4的表達來實現，促進BMSCs向成骨細胞分化。張波等[49]通過髓芯減壓后股骨頭內注射富血小板血漿(PRP)，研究結果顯示，PRP與BMSCs能改善股骨頭壞死的恢復情況，其作用是通過上調BMP-2的蛋白水平，激活Smads信號通路，繼而誘導間充質干細胞向成骨方向分化，達到骨組織修復和愈合的目的。且MAPK[50]、Notch[51]、Wnt[52]等信號通路都參與成骨細胞分化和骨形成的調節。張遙等[53]通過7～9個以上軟件對7種miRNAs所預測靶基因相關的KEGG信號通路中，發現共有的信號通路為Focal adhesion信號通路、MAPK信號通路、Notch信號通路。所以，多種信號通路在NONFH的發生和發展過程中有一定的作用，但是其相互之間又有協同或拮抗作用，具體的作用機制還有待進一步的深入研究。

8 展望

NONFH是一個受多種因素共同參與的復雜的髖關節疾病，目前該病的具體發病機制還不明確。隨著對其研究的不斷深入，與股骨頭壞死相關的潛在生化標記物的研究己取得可喜的成果，但由于研究對象種族的不同、檢測方法及指標的差異及研究角度的不同，研究結論還存在不一致，且缺乏特異性和敏感性生化標記物，目前仍有許多問題有待于更進一步深入研究。大量的研究證據表明信號通路在NONFH的發生和發展過程中具有重要的調控作用，且是受多信號通路調控的結果，且相關信號通路的調控具有交叉作用，近年來隨著對NONFH的研究深入，如血管內皮生長因子(VEGF)、脂肪酸轉運蛋白1(Fatty acid transport protein-1,FATP-1) 等信號通路在NONFH中也具有一定的調控作用，但是具體的機理仍需進一步闡明，希望能在今后的研究中進一步對其作用機制有深入的發現，為NONFH的防治找到靶點，指導臨床的用藥治療，讓NONFH可防可治。