抑制性Smads在肝纖維化發生發展中的表達變化

李建勛 李艷 何陽

(1. 武警貴州省總隊離職干部休養所，貴州 貴陽 550002；2.貴陽市公共衛生救治中心，貴州 貴陽 550002；3.貴陽市第一人民醫院，貴州 貴陽 550001)

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·論 著·

抑制性Smads在肝纖維化發生發展中的表達變化

李建勛1李艷2何陽3

(1. 武警貴州省總隊離職干部休養所，貴州 貴陽 550002；2.貴陽市公共衛生救治中心，貴州 貴陽 550002；3.貴陽市第一人民醫院，貴州 貴陽 550001)

目的 觀察抑制性Smads(Smad 6, Smad 7)在肝纖維化大鼠肝臟中的表達變化并探討它們在肝纖維化發生發展中可能的作用。 方法 選取Wistar大鼠20只，隨機分為正常組和肝纖維化模型組，每組各10只。通過皮下注射40% CCl4植物油溶液制備肝纖維化動物模型，注射劑量為0.4 mL/100 g體質量，每周注射2次，造模時間總計為12周。采用Western Blot檢測肝臟中Smad 6及Smad 7蛋白的表達變化；采用PCR技術檢測肝臟中Smad 6及Smad 7 mRNA的改變。結果 Western Blot檢測顯示，與正常組大鼠比較，模型組大鼠肝臟中Smad 6及Smad 7蛋白的表達顯著減少；同時PCR檢測發現模型組大鼠肝臟中Smad 6及Smad 7 mRNA的表達也較正常組大鼠明顯降低。結論 肝纖維化過程中抑制性Smads在基因及蛋白水平表達下調可能是促進肝纖維化發生發展的一個重要因素。

肝纖維化； Smad 6； Smad 7； 大鼠

肝纖維化是眾多慢性肝病患者共有的病理變化，在各種病因所致慢性肝損傷的過程中，可通過激活肝星狀細胞產生大量以Ⅰ、Ⅲ型膠原為主的細胞外基質，從而形成肝纖維化[1]。Smads蛋白家族屬于細胞內信號轉導蛋白，在哺乳類動物組織中共發現10 種不同的Smads蛋白[2]，這些Smads蛋白可根據其功能不同分為3 個亞族，分別是R-Smad、Co-Smad 和I-Smad，其中Smad 6 及Smad 7 屬于I-Smad[3]。本研究擬用CCl4復制大鼠肝纖維化動物模型，觀察各組大鼠肝組織中抑制性Smads(Smad 6，Smad 7)的表達變化，并探討它們在肝纖維化發生發展中可能的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑 (1)大鼠多克隆Smad 6，Smad 7抗體購自武漢博士德公司；(2)甘氨酸、丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷、過硫酸銨、十二烷基硫酸鈉購自北京鼎國公司；(3)ECL化學發光試劑由碧云天生物技術有限公司提供；(4)PVDF膜購自美國Millipore公司；(5)SYBR Green及逆轉錄試劑盒購自美國Invitrogen公司；(6)引物委托大連寶生物公司設計合成。引物序列如下：Smad 6：上游引物5’-AAAGACGCACTTTTGGCTTA 3’，下游引物5’-CGAATACTTTTATTATCGAGTGACTG 3’；Smad 7：上游引物5’-TGTCCACAGGCTTCTGAG 3’，下游引物5’-TCTCTCAAAGCACTACAATGC 3’。

1.2 動物模型 雄性Wistar大鼠20只，體質量150～160 g，實驗動物隨機分為兩組：正常組及肝纖維化模型組(模型組)，每組各10只。經皮下注射40% CCl4花生油溶液制備肝纖維化大鼠模型，注射劑量為0.4 mL/100 g，每周注射2次；正常組大鼠則注射等量花生油溶液。于12周末處死大鼠，取每只大鼠相同部位的肝組織固定于4%中性甲醛溶液中，剩余肝組織保存于-80 ℃低溫冰箱中以備進行Western Blot及PCR檢測。

1.3 實驗指標檢測 肝臟切片經HE染色后在光學顯微鏡下觀察病理學變化。Western blot 檢測肝臟中Smad 6，Smad 7蛋白表達，提取肝臟總蛋白并進行蛋白定量，經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，隨后將蛋白質轉印到PVDF膜上，之后將PVDF膜置于封閉緩沖液中室溫下封閉1 h。封閉完成后將PVDF膜與一抗稀釋液(Smad 6按1∶500稀釋，Smad 7按1∶1 000稀釋)4 ℃封閉過夜。次日早上將PVDF膜與二抗稀釋液(1∶2 000)在室溫下孵育2 h，洗膜緩沖液洗膜3次后加入化學發光試劑，室溫反應1 min后暗室中進行曝光。Real-time PCR 檢測肝臟中Smad 6，Smad 7 mRNA表達 提取肝組織總RNA并定量，逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR 反應，反應條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，最后兩步重復40個循環。

2 結 果

2.1 肝臟病理改變 正常大鼠肝臟結構正常，肝小葉結構清晰，無炎癥細胞浸潤及膠原纖維增生；模型組大鼠肝臟內膠原纖維增生明顯增多，增多的膠原纖維重新包繞、分割肝組織，有假小葉形成。各組大鼠肝臟病理改變見圖1。

2.2 肝臟中Smad 6，Smad 7蛋白表達 正常大鼠肝臟內可見Smad 6，Smad 7蛋白表達；模型組大鼠肝臟中Smad 6，Smad 7蛋白的表達較正常組大鼠顯著減少，差異具有顯著性。大鼠肝臟中Smad 6，Smad 7蛋白表達見表1、圖2。

2.3 肝臟中Smad 6，Smad 7 mRNA表達 與正常組大鼠比較，模型組大鼠肝臟中Smad 6，Smad 7 mRNA的表達較正常組大鼠顯著減少，差異具有顯著性。各組大鼠肝臟中Smad 6，Smad 7 mRNA表達見表1。

表1 大鼠肝臟中Smad 6，Smad 7蛋白及 mRNA表達

注: 與正常組比較,▲P<0.01；與正常組比較,△P<0.05。

3 討 論

肝纖維化是在持續存在的肝損傷病因作用下，肝組織發生修復時細胞外基質合成與降解失衡而引起的一種病理改變[4]。大量研究證實TGF-β表達持續增高與肝纖維化發生發展密切相關[5-6]，而Smads蛋白家族是TGF-β細胞內信號轉導過程中極為重要的信號分子[7-8]。研究證實，TGF-β的二聚配體與細胞膜表面的Ⅰ型受體結合使其活化，活化后的Ⅰ型受體進一步使Smads家族中的受體型Smads(Smad 2/3)發生磷酸化，并與胞漿內的Smad 4形成復合體，該復合體可從細胞漿轉移到細胞核，從而調節下游靶基因的轉錄[9]。而研究發現Smads家族中的抑制性Smads(Smad 6, Smad 7)可抑制Smad 2/3/4復合體轉移至細胞核，從而阻斷TGF-β的信號轉導，發揮抗纖維化的作用[10]。而抑制性Smads在肝纖維化大鼠肝臟中的表達變化及作用目前尚不十分清楚。

本次研究發現，模型組大鼠肝小葉結構破壞，肝組織內纖維結締組織大量增生，纖維化程度較正常組大鼠顯著增加。同時，本研究還觀察到模型組大鼠肝臟中Smad 6及Smad 7 mRNA表達較正常組大鼠顯著減少；此外，肝纖維化大鼠肝臟中Smad 6及Smad 7蛋白的表達也較正常大鼠顯著降低，這一變化趨勢與Smad 6及Smad 7基因的變化趨勢一致。由于Smad 6及Smad 7屬于Smads家族中的抑制性Smads，正常情況下它們可拮抗受體激活的Smads蛋白(Smad 2/3)介導的信號轉導，從而形成控制TGF-β致纖維化效應的負反饋機制。而肝纖維化時尤其是肝纖維化晚期，由于Smad 6及Smad 7在基因及蛋白水平的表達均顯著下調，使得其對TGF-β/Smad 2/3信號轉導通路的抑制作用減弱，因此肝組織細胞在TGF-β/Smad2 /3信號轉導通路的調控下，導致下游促纖維化的細胞因子及細胞外基質成分如Ⅰ/Ⅲ型膠原等基因大量轉錄合成，從而進一步促進了肝纖維化的發生和發展。

(本文圖1，圖2見封三)

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[2] 唐靜，戴立里，咼琳琳，等. 肝纖維化中丹參素對TGFβ1/Smads/ERK信號通路的影響及其相互關系[J]. 第三軍醫大學學報，2011,33(11):1159-1164.

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Expression change for the occurrence and development of inhibitory Smads in hepatic fibrosis

LiJianxun1,LiYan2,HeYang3.

1.CadreRetreatSanatoriumofGuizhouProvincialArmedPoliceCorps,Guiyang550002,China. 2.GuiyangCityPublicHealthCenter,Guiyang550002,China. 3.TheFirstPeople'sHospitalofGuiyangCity,Guiyang550002,China

Objective To observe the change of inhibitory Smads(Smad 6, Smad 7)during liver fibrosis and to explore their effects on hepatic fibrosis. Methods Twenty Wistar rats were randomly divided into normal control group and 12 weeks liver fibrosis group. Liver fibrosis model was induced by hypodermic injection of 40% CCl4，the dosage of CCl4 is 0.3ml/100g body weight. Protein of Smad 6 and Smad 7 were detected by western blot (WB), and mRNA of Smad 6 and Smad 7 were detected by real-time PCR. Results Compared with normal control group, the levels of Smad 6 and Smad 7 protein in 12 weeks liver fibrosis group were decreased. Meanwhile, the levels of Smad 6, Smad 7 mRNA in 12 weeks liver fibrosis groups were decreased. Conclusion Down regulation of inhibitory Smads at gene and protein level may promote the development of liver fibrosis.

Hepatic fibrosis； Smad 6； Smad 7； Rat

R363

A

1000-744X(2016)05-0451-02

2015-12-18)