腦梗死患者MTHFR基因多態性檢測的意義

高波 陳杰 余宗濤 李文翠 張吉才△

(1.湖北醫藥學院附屬太和醫院檢驗科,湖北 十堰 442000；2.泰州市姜堰區第三人民醫院心內科，江蘇 姜堰 225500)

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腦梗死患者MTHFR基因多態性檢測的意義

高波1陳杰2余宗濤1李文翠1張吉才1△

(1.湖北醫藥學院附屬太和醫院檢驗科,湖北 十堰 442000；2.泰州市姜堰區第三人民醫院心內科，江蘇 姜堰 225500)

目的 分析腦梗死患者MTHFR C677T基因多態性與勁動脈內中膜厚度及外周血中同型半胱氨酸(HCY)水平的關系。方法 收集腦梗死患者100例，芯片法檢測MTHFR C677T基因多態性，根據多態型結果分為CC型、CT型、TT型；檢測不同多態型患者內中膜厚度以及外周血中HCY濃度水平。結果 腦梗死患者中MTHFR C677T 基因CC型、CT型、TT型的檢出頻率分別為19，49，32%； CC型、CT型、TT型患者內中膜厚度分別為(0.65±0.13)、(0.91±0.31)、(1.29±0.48)，差異具有統計學意義(P<0.05)；CC型、CT型、TT型患者HCY水平分別為(10.03±3.24)、(12.04±2.89)、(14.19±3.03)，差異具有統計學意義(P<0.05)。結論 MTHFR C677T基因突變可能是引起高HCY血癥的一個重要遺傳因素，并且可能增加腦梗死患者動脈粥樣斑塊形成的風險。

亞甲基四氫葉酸還原酶； 同型半胱氨酸； 腦梗死； 多態性； 內中膜

腦梗死是一種常見的局限性腦組織軟化或壞死疾病，在我國的腦血管疾病中呈逐步增高趨勢。引起腦梗死的危險因素很多，如年齡、肥胖、高血糖以及高血壓等。5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶MTHFR是葉酸代謝過程中的關鍵酶，在HCY向蛋氨酸轉化以及DNA合成過程中發揮著重要作用。C677T多態性引起的高同型半胱氨酸血癥可誘導內皮細胞激活促凝因子，使機體處于高凝狀態，從而促進血栓形成。頸動脈內中膜(IMT)增厚往往是早期粥樣硬化的一個敏感指標[1]。腦梗死的發病往往帶有不確定性，特別對于沒有明顯癥狀的急性患者。所以對于腦梗死患者來說預防大于治療。本文通過檢測MTHFR C677T基因的多態性，從基因多態性角度分析MTHFR C677T基因突變與高HCY血癥以及內中膜厚度之間的關系，探討基因多態性在腦梗死發病過程中的作用，為腦梗死的個體化診治提供一定的理論依據。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集我院2011年1月至2014年12月門診或住院腦梗死患者100例，其中男性64例，女性36例，平均年齡(61.4±19.1)歲。腦梗死診斷需符合《全國第四屆腦血管病學術會議修訂》的標準，需經影像學CT或MRI診斷確診。排除標準：(1)嚴重的肝腎功能不全；(2)各種原因導致的出血性腦血管疾病；(3)昏迷病人；(4)后循環腦梗死患者。所有患者抽取肝素鈉抗凝血3 mL用于HCY 水平的檢查，標本采集后離心留取血漿-80 ℃保存備用，EDTA-K2抗凝血3 mL用于全血基因組DNA提取。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器 全血DNA提取試劑盒(北京天根)；ND-2000微量核酸定量儀(Thermo公司)；PE7500擴增儀(ABI)；AU2700全自動生化儀(貝克曼)；基因芯片儀，芯片識讀儀(上海百傲)；彩色多普勒超聲診斷儀(Vivid7，GE公司，美國)； HCY濃度檢測試劑盒(北京九強)。

1.2.2 HCY濃度檢測 HCY在全自動生化分析儀上進行檢測，所有試劑均采用配套試劑盒，定標后測試，正常參考區間按照說明書進行設置。

1.2.3 頸動脈IMT厚度測量 所有檢測人員充分暴露頸部，測量部位一般為頸總動脈離分叉處1～2 cm，頸外動脈離分叉處1 cm，頸內動脈離分叉處1 cm。正常IMT厚度≤1 mm，頸總動脈膨大≤1.2 mm。判斷標準：將頸總動脈>1 mm，頸總動脈膨大處>1.2 mm并突向管腔內，則判斷為粥樣斑塊形成，并詳細記錄斑塊的基本特征如大小、部位、形態以及回聲等。

1.2.4 外周血中DNA提取 EDTA抗凝血采集后需按照試劑盒操作說明提取外周血中的全基因組DNA，若不能及時提取應4℃保存，一般不宜存放超過1周。提取后的DNA經微量核酸定量儀測定其濃度和純度后進行PCR擴增或者-80℃保存備用。

1.2.5 PCR擴增 提取后的DNA經過PCR擴增獲取PCR產物。擴增條件為：50 ℃ 5 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 25 s，72 ℃ 25 s，35個循環；72 ℃ 5 min。獲取的擴增產物需進行雜交反應或-20 ℃保存備用。

1.2.6 雜交及芯片識讀 對上述PCR產物進行雜交，雜交體系及雜交條件參照說明書進行。雜交結束后將芯片放置于芯片識讀儀中對結果進行掃描判定，根據所得結果將所有患者分為CC型、CT型、TT型。

2 結 果

2.1 所有腦梗死患者MTHFR C677T基因多態性分析 100例腦梗死患者中MTHFR C677T 基因CC型、CT型、TT型的檢出頻率分別為19%、49%、32%，等位基因頻率為C43.5%、T56.5%。腦梗死患者不同基因型(CC型、CT型、TT型)的判讀結果見圖1。

圖1 MTHFR C677T 基因多態性結果

2.2 不同基因型患者IMT、HCY濃度的變化 統計學分析發現，IMT厚度以及HCY濃度均為CC型

表1 不同基因型患者IMT、HCY濃度的變化

注:*P<0.05,△P<0.05。

3 討 論

5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶MTHFR是葉酸代謝過程中的關鍵酶，在葉酸代謝過程中起到重要作用。MTHFR有多個位點容易發生突變，其中最常見的基因突變是677位核苷酸突變為CC、CT、TT三種。MTHFR 677位點雜合型CT突變和純合型TT突變可以影響到該酶的活性，葉酸濃度降低，蛋氨酸合成減少，進而使得HCY淤積過多，產生高HCY血癥。頸動脈的內中膜厚度IMT與心腦血管疾病的發生密切相關，通過頸動脈彩超測定IMT厚度是預防腦梗死的一種簡單有效、無創、方便、經濟的方法。

微陣列技術就是利用分子雜交原理，使同時被比較的標本(用同位素或熒光素標記)與微陣列雜交，并包被于芯片上，通過檢測包被芯片雜交信號強度及數據處理，用一種直觀圖像反映出基因多態性

的分型，常常用于遺傳性基因多態性的分析。本文采用DNA微陣列芯片法檢測腦梗死患者外周血中MTHFR基因多態性發現，MTHFR C677T 基因CC型、CT型、TT型的檢出頻率分別為19%，49%，32%，可以很好的檢出MTHFR C677T基因多態性分型。研究[2]表明CT型、TT型的基因突變可以降低MTHFR的酶活性，導致葉酸代謝途徑障礙。這就使得突變型的腦梗死患者由于MTHFR酶活性的降低導致高HCY血癥，HCY又可以損傷內皮細胞，激活促凝血因子，進而促進纖溶酶激活物抑制劑的表達，抑制硫酸肝素的合成，促進血小板粘附聚集，使得機體處于高凝狀態，導致血栓的形成[3-5]，進而增加腦血管疾病發生的風險。而如果通過基因檢測，對于突變型的患者攝入一定劑量的葉酸，早期進行葉酸干預，提高酶活性，同樣可以維持正常的HCY代謝濃度，降低由于高HCY血癥導致的血管損害及并發癥的發生。這為腦梗死患者的診治提供了一定的個體化依據。

本研究發現，無論是IMT厚度，還是HCY濃度，均為CC型

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