microRNAs在結直腸癌患者糞便中的表達及其臨床意義

肖興元 王永強△ 楊潔 張大平 徐健 楊熊飛

(1.昆山市第一人民醫院肛腸外科，江蘇 昆山 215300；2.甘肅省人民醫院肛腸外科，甘肅 蘭州 730000)

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microRNAs在結直腸癌患者糞便中的表達及其臨床意義

肖興元1王永強1△楊潔1張大平1徐健1楊熊飛2

(1.昆山市第一人民醫院肛腸外科，江蘇 昆山 215300；2.甘肅省人民醫院肛腸外科，甘肅 蘭州 730000)

目的 探討miR-16、miR-21、miR-29a、miR-106a及miR-143在結直腸癌(CRC)患者中的表達特點，評價糞便中microRNAs的表達水平檢測對于CRC的診斷價值。方法：采用病理對照研究方式，選取47例CRC患者以及30例健康體檢者進行對比研究，采集納入人群的糞便標本，應用實時熒光定量PCR技術檢測患者檢測其糞便中的miR-16、miR-21、miR-29a、miR-106a及miR-143表達水平，并比較16例行CRC根治性手術患者于術前1 d以及術后7 d糞便中的miRNAs的變化情況。結果：CRC患者糞便中的miR-16、miR-21、miR-106a表達水平明顯高于健康對照組，在CRC患者腫瘤切除后7 d其糞便的miR-16以及miR-106a的表達水平明顯低于術前(P<0.05)。結論 miR-16、miR-21、miR-106a可以作為結直腸癌的新的腫瘤標志物。

結直腸癌； 微小RNAs； 糞便

我國結直腸癌(CRC)發病率逐年增高，結直腸腫瘤的早期診斷和治療能延長患者生存期，提高生存質量，降低社會醫療成本。成熟的微小RNA(microRNAs，miRNA)是一類不編碼蛋白質的單鏈小RNA，對基因表達起到調節作用[1]。miRNA的特異性表達與腫瘤的發生和發展有關，甚至起到抑癌基因或癌基因的效果。研究[2]發現，常見的miRNAs有十幾種，其中常見的有miR-16、miR-21、miR-29a、miR-106a及miR-143。本研究旨在探討聯合檢測糞便中的上述標志物在診斷CRC及其主要早期病變CRA中的意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2012年1月至2014年1月間于我院住院治療的47例結直腸癌患者(結直腸癌組)，其中男29例，女18例，年齡43～73歲，平均年齡(57.2±3.7)歲，均經術后病理確診為腺癌，入院前未予以任何放化療處理；其中結腸癌32例、直腸癌15例。病理學類型：中分化30例、低分化17例。伴淋巴結轉移29例、無淋巴結轉移18例。選取同時期于我院行健康體檢者30例作為健康對照組，其中男18例，女12例，年齡42～75歲，平均年齡(55.9±5.3)歲，兩組患者的年齡、性別等基本資料間比較無明顯差異，具有可比性，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 制備標本 將糞便標本收集后加入40 mL的緩沖液[含有Hanks溶液、10%胎牛糞便以及25 mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)緩沖液，pH值為7.35]中將其混勻，以200 r/min的速度離心1 min，離心半徑18 cm，隨后利用孔徑為512 μm的濾紙作過濾處理。向濾液中加入80 μL免疫磁珠，在室溫下孵育45 min，隨后在-80 ℃冰箱中保存備用。

1.2.2 提取RNA 將500 μL標本置于離心管中，在75 ℃條件下預熱5 min，42 ℃條件下孵育1 h，提取RNA。具體步驟：向處理后的樣本中加入等體積的TRIzol試劑，混勻，室溫下靜置5 min；加入200 μL三氯甲烷，振蕩15 s后繼續靜置2 min；4 ℃、12 000 r/min條件下離心15 min，取上清液；加入等體積異丙醇，混勻，-20 ℃沉淀過夜后，4 ℃、12 000 r/min條件下離心10 min，棄上清液；向沉淀中加入500 μL質量分數0.7的乙醇，將沉淀洗滌，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，離心半徑10 cm，棄上清液；將沉淀晾干，用適量焦碳酸二乙酯(DEPC)溶液將其溶解，得到純化后的RNA樣本。

1.2.3 miRNAs定量分析 實時定量RT-PCR技術檢測10 μL預處理過的RNA樣本。糞便標本中的內參照為U6小核RNA(small nuclearRNA，snRNA)L4J。具體過程：加入1 μL 2 μmol/L引物、1 μL 10 mmol/L=磷酸脫氧核糖核苷(dNTP)、4 μL 5×反轉錄緩沖液、1 μL RNase抑制劑、1 μL反轉錄酶、1 μL 0.1 mol/L二硫蘇糖醇(DTT)溶液。反應總體積為20 μL，在16 ℃中反應5 min，42 ℃中反應1 h，82 ℃中反應5 min。取2 μL反轉錄獲得的cDNA用于實時熒光定量PCR，反應體系為2.5 μL 10×PCR擴增緩沖液、0.5 μL 2.5mmol/LdNTP、1 μL熒光綠染料(SYBRGreenI)、0.2 μL 5U/μL Taq、1 μL擴增引物，加去離子水使反應體系達25 μL。反應條件為95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，60 ℃ 15 s，共40個循環，每份樣本重復2次。測定mi-R21、miR-106a及其內參照的Ct(thresholdcycle)值，△Ct-Ct目的基因-Ct內參照基因，miR-16、miR-21、miR-29a、miR-106a及miR-143的相對含量為2-△Ct。

2 結 果

2.1 五種miRNAs在CRC患者糞便中的表達水平比較 與健康對照相比，miR-16、miR-21 及miR-106a在結直腸癌患者糞便中的表達水平明顯升高，組間比較差異有統計學意義(P<0.05),而miR-29a以及miR-143在兩組患者糞便中的表達水平之間比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 miRNAs在兩組間的表達水平比較

2.2 不同分化程度結直腸癌患者的糞便miR-16、miR21 及miR-106a表達比較 根據患者的術后病理診斷結果將47例結直腸癌不同分化程度，將CRC患者分為中分化30例以及低分化17例，結果顯示，miR-16、miR-21 及miR-106a表達水平在中、低分化組中表達差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 不同分化CRC患者的miR-16、 miR-21 及miR-106a表達水平比較

2.3 手術前后結CRC患者的糞便miRNAs水平比較 對于行結直腸癌根治手術治療的16例患者，比較手術前1 d以及術后7 d的糞便miRNAs的表達情況。結果顯示，miR-16以及miR-106a表達水平于術后7 d的表達水平明顯降低，組間比較有統計學差異(P<0.05),而miR-21在術后的表達水平無明顯變化(P>0.05)，見表3。

表3 手術前后患者的miRNAs水平比較

3 討 論

現在對于CRC早期診斷的主要方法有糞便隱血檢查、結腸鏡檢查、鋇灌腸氣鋇雙重造影以及糞便RNA特異性基因檢測等[2]。結腸鏡檢查的靈敏度雖較高，對于高危人群或疑似患者的檢查能夠有效降低結直腸癌患者的死亡率[3]。但是其需要較高的檢查費用，檢查準備工作較為繁瑣，檢查過程難免痛苦，人群接受率不高。目前還不能進行推廣。有研究[4-5]指出結直腸腫瘤特異性DNAs1以及RNAs等標志物的檢測效果較好，其中miRNA可能作為一個預后的良好指標。有研究[6]指出不同的腫瘤都具有各自不種類型的特異性miRNAs表達譜，應用高通量微陣列芯片技術分析了前列腺癌、大腸癌、卵巢癌、乳腺癌及肺癌糞便miRNAs表達譜后發現，通過對患者的糞便miRNAs表達譜進行檢測能夠有效辨別腫瘤的類型。S.Mi等[7]研究證實miR-106a以及和miR-173p在結直腸癌患者的血漿中明顯表達升高，在腫瘤切除術后表達水平明顯下降。此外，研究[8]指出miR-21在結直腸癌以及食管癌患者的糞便中表達水平上升，提示其有可能成為多種腫瘤的診斷和預后指標。通過本次研究結果可以看出，相比于健康對照組，CRC患者糞便中的miR-16、miR-21 及miR-106a表達水平明顯上升(P<0.05),但是miR-29a以及miR-143a表達水平則無明顯變化，miR-16、miR-21 及miR-106a在低分化和中分化CRC患者糞便中表達水平無明顯差異，提示miR-16、miR-21 及miR-106a異常高表達有助于早期診斷CRC，但無法鑒別診斷中、低分化程度的CRC。通過比較CRC根治術患者術前、術后糞便中的miRNAs表達水平可以看出miR-16以及miR-106a在患者術后7 d的表達水平明顯下降，且趨于正常水平，提示糞便中上升的miR-16以及miR-106a可能來源于腫瘤組織的釋放，術后對其監測有助于評判患者的預后。

[1] 張人華,鄒美平， 李珀，等.KLF6、KLF4及APC基因蛋白在結直腸癌中的表達和意義[J].貴州醫藥,2013,37(7):579-581。

[2] Huang Z,Huang D,Ni S.Plasma microRNAs are promising novel biomarkers for early detection of colorectal cancer[J].International Journal of Cancer,2010，127(1)：118-126.

[3] 王海艷，許春偉，吳永芳，等.結直腸癌患者腫瘤組織中KRAS和BRAF基因突變的分子病理檢測分析[J].貴州醫藥,2015，39(11):961-963.

[4] Yu G,Tang JQ,Tian ML.Prognostic values of the miR 17-92 cluster and its paralogs in colon cancer[J].Journal of Surgical Oncology,2012，106(3)：232-237.

[5] Wu CW,Ng SS,Dong YJ.Detection of miR-92a and miR-21 in stool samples as potential screening biomarkers for colorectal cancer and polyps[J].Gut,2012，61(5)：739-745.

[6] Osada H,Takahashi T.let-7 and miR-17-92:small sized major players in lung cancer development[J].Cancer Science,2011，102(1)：9-17.

[7] Mi S,Li Z,Chen P.Aberrant overexpression and function of the miR-17-92 cluster in MLL-rearranged acute leukemia[J].Proceedings of the National Academy of Sciences(USA),2010，107(8)：3710-3715.

[8] Duan YF,Li DF,Liu YH.Decreased expression of DAB2IP in pancreatic cancer with wild-type KRAS[J].Hepatobiliary & Pancreatec Diseases International,2013,12(2):204-209.

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