微小RNA在心肌纖維化中的作用機制

張莉絲 賈瓊瓊 邵素霞

(河北醫科大學組織胚胎學教研室，河北 石家莊 050017)

微小RNA在心肌纖維化中的作用機制

張莉絲 賈瓊瓊 邵素霞

(河北醫科大學組織胚胎學教研室，河北 石家莊 050017)

微小RNA;心肌缺血;心肌纖維化

微小RNA(miRNA)是一種在進化中高度保守的，由18～26個核苷酸組成的內源性單鏈非編碼小分子RNA，目前人類已經檢測出了1 000多個。miRNA結合位點通常在mRNA 3'端非翻譯區，通過其配對蛋白質編碼基因中mRNA調控靶基因，降低反轉錄效率和(或)mRNA水平〔1〕，每個miRNA可有多個靶基因，多個miRNA也可調節同一個基因，從而實現基因的調控作用。因此，miRNA雖然僅占真核細胞基因組的1%～2%，但卻調節編碼基因的30%〔2〕。miRNAs參與調控多種細胞生物學過程，在增殖分化凋亡代謝〔3～6〕等方面發揮重要作用。目前發現一些miRNAs與心血管系統發育和心血管疾病發生發展密切相關〔7～9〕。而大量研究〔10～35〕表明多種miRNAs參與了心肌纖維化。本文綜述miRNA在心肌纖維化中的作用。

1 心肌纖維化

心肌纖維化是多種心臟疾病的共同難題，與心肌病、心肌梗死、心律失常、慢性心力衰竭等密切相關。當心臟缺血或發生炎癥時造成心肌損傷和(或)負荷增加，代償機制激活導致心肌肥大、心肌纖維化和心室重構。心室重構激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)〔36,37〕，使血管緊張素(Ang)Ⅱ分泌增多，刺激心肌成纖維細胞增殖，膠原蛋白合成增加,使原有的膠原增粗,新膠原沉積于原來缺乏膠原的心肌間質內,膠原體積比例增加，導致心肌間質內正常結構被破壞,使促纖維化細胞因子如轉化生長因子(TGF)-β分泌增多，基質金屬蛋白酶(MMPs)失調，發生了間質纖維化。MMPs是一組鋅離子(Zn+)依賴的內肽酶家族，主要功能是調節細胞外基質代謝，組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs) 是MMPs的特異性抑制劑，MMPs/TIMPs的比例失調是導致心室重構的重要因素。多年來除了抑制RAAS，尚且還沒有治療心肌纖維化的有效方法，最近，miRNA的相關研究為治療心臟缺血后纖維化提供了新方向。

2 miRNA參與心肌纖維化

2.1miR-21 miR-21可參與多個病理過程，包括癌癥、心肌肥大和纖維化的發展。Liang等〔10〕發現小鼠心肌梗死區的周圍區域內miR-21表達上升，TGF-β受體(R)-Ⅲ表達下降，這表明miR-21與心肌纖維化有關；Kumarswamy等〔11〕證實過表達miR-21的心肌成纖維細胞中TGF-βRⅢ表達減少而膠原蛋白的含量增加，表明TGF-βRⅢ是miR-21的靶基因，而TGF-βRⅢ可下調TGF-β1，TGF-β1已被證實與miR-21是正調節關系，因此miR-21通過下調TGF-βRⅢ來促進TGF-β1的表達從而導致心肌纖維化。Roy等〔12〕發現上調miR-21可誘導心肌纖維化從而導致小鼠心肌缺血，進一步證實miR-21抑制人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)和腫瘤抑制基因，使磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B信號失活，影響了心肌成纖維細胞生長、增殖、分化、遷移、存活和細胞內運輸。磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B通路激活MMP-2和TIMPs，從而擾亂細胞外基質中的微妙平衡。Spry1是絲裂酶原蛋白激酶途徑的重要抑制劑，在小鼠壓力超負荷心功能不全模型〔13〕和大鼠心肌梗死模型〔14〕中，敲除miR-21可以使Spry1蛋白表達上調，抑制心肌成纖維細胞增殖和成纖維細胞生長因子2分泌，從而使心臟間質纖維化減弱。Adam等〔14〕在房顫病人中用抗miR-21藥物治療后，Spry1表達上調，抑制心肌梗死后纖維化。Tatsuguchi等〔15〕證實培養心肌細胞中轉染miR-21抑制劑后，miR-21抑制劑使乳大鼠心肌肥厚。提示TGF-βRⅢ和TGF-β1通過miR-21參與纖維化發展，三者密切相關。以上研究成果表明miR-21對調節缺血后心肌纖維化起著非常顯著的作用，盡管抑制miR-21在一定程度上減少了纖維化，但miR-21的抑制能夠加重心肌細胞肥大。心室重構是纖維化和心肌肥厚共同導致的結果，因此，在miR-21被用于預防心肌纖維化的治療之前，需要深入研究。

2.2miR-29 miR-29家族包含3個成員：miR-29a，miR-29b和miR-29c。整個miR-29家族上調可以減少細胞外基質的形成，從而預防心肌纖維化。van Rooij等〔16〕分析證實細胞外基質的組成部分中幾個基因編碼的3'-端非翻譯區，包括彈性蛋白(ELN)，原纖維蛋白(FBN)1，膠原蛋白Ⅰ型α1(COL1A1)和COL1A2和膠原蛋白Ⅲα1(COL3A1)，會有1個或多個潛在的結合位點對應著miR-29的序列。心肌成纖維細胞經pCMV6載體轉染miR-29后，分泌總膠原蛋白減少；為了進一步驗證此現象，進行體內實驗，與假手術組相比小鼠心肌梗死后第3天miR-29的表達下調，尤其在心肌梗死邊緣區下調得更加顯著，同時COL1A1、COL1A2、COL3A1和FBN1的表達在心肌梗死邊緣區明顯增加。Soci等〔17〕把雌性Wistar大鼠分為3組，分別做不同強度的有氧運動(游泳)，結果發現大鼠心臟中的miR-29隨有氧運動強度的增加表達上調，相應的膠原蛋白表達較少，這個發現進一步為miR-29可以防止心肌纖維化提供了強有力的證據。然而，其他一些研究〔18～20〕證實miR-29可通過對抗凋亡基因的負性調節促進心肌細胞凋亡，如B細胞淋巴瘤(Bcl)-2，細胞分裂周期(CDC)42和T-細胞白血病/淋巴瘤(TCL)-1。這就說明miR-29作為基礎治療可能對心肌細胞和成纖維細胞起相反的生物學作用。

上述研究表明miR-29家族一方面可通過阻斷膠原的表達改善了缺血后的心室重塑，另一方面它卻誘發心肌細胞的凋亡并且可能導致心力衰竭。miR-29的這些效果取決于心肌梗死基礎治療的時機。在早期階段，抑制miR-29可以通過抑制心肌細胞凋亡防止心力衰竭，而在后期階段(心肌梗死后2個星期)，刺激miR-29可保護心臟防止纖維化〔21〕。

2.3miR-24 miR-24的過表達可抑制心肌梗死后心肌纖維化。Wang等〔22〕在小鼠心肌梗死模型中發現在前3 w miR-24表達低于假手術組但呈上升趨勢，在第4周上升并超過正常值；膠原蛋白Ⅰ型、纖連蛋白和TGF-β1表達在第1周達到高峰，隨后逐漸降低，在第4周時恢復到正常水平。為了進一步確定miR-24在此過程中的作用，他們向梗死小鼠心臟注射以病毒為載體的miR-24，發現miR-24不僅改善了心功能，而且在梗死邊緣區的纖維化減弱(與對照組相比梗死區面積縮小了36.9%)。體外實驗證實，miR-24的過表達使心肌成纖維細胞中的促纖維化細胞因子COLI、α-平滑肌肌動蛋白(SMA)表達降低，也使心肌成纖維細胞的遷移和分化降低。這些結果共同表明了miR-24在缺血后纖維化的調節中起著重要作用。

2.4miR-101 miR-101早期研究證明其可以抑制癌細胞浸潤組織〔23～26〕，同時在調解血管內皮細胞層流剪切應力方面也有抑制作用。后續研究證實其與心血管疾病密切相關。Pan等〔27〕采用冠狀動脈結扎制作大鼠心肌梗死模型，4 w后梗死邊緣區miR-101a和miR-101b(miR-101a/b)的表達下降，而miR-101a的過表達可顯著改善心肌梗死大鼠左心室的收縮功能。體外研究證實經AngⅡ刺激后的新生大鼠心肌成纖維細胞中miR-101a/b表達下調。miR-101a/b的過表達抑制了心肌成纖維細胞的增殖和分化，再與AMO-101a/b(miR-101a/b抑制劑)共轉染后，miR-101a/b表達減少，加重了心肌成纖維細胞纖維化。研究者〔27〕發現miR-101過表達可降低FBJ骨肉瘤癌基因(FOS)及FOS下游蛋白TGF-β1的表達，認為FOS是miR-101的直接靶基因。成纖維細胞中轉染FOS siRNA抑制劑后，成纖維細胞增殖能力下降和TGF-β1表達減少。這說明miR-101通過抑制FOS的表達，使TGF-β1表達下降，從而有效地阻止了纖維化進程。

2.5miR-206 高遷移率族蛋白(HMG)B1是一種核蛋白，其能夠調節再生過程〔28〕，并與組織修復關系密切。Limana等〔29〕采用冠狀動脈結扎制備成年小鼠心肌梗死模型，3 w后將200 ng HMGB注射到小鼠心臟的心肌梗死周邊區域，4 w后檢測證實小鼠心臟功能明顯改善，心臟重構減弱。HMGB1治療3 d后，在梗死邊緣區和梗死區miR-206表達是對照組的4～5倍，是假手術組左心室的20～25倍。用HMGB作用于體外培養心肌成纖維細胞時發現心肌成纖維細胞中miR-206表達增加，而miR-206的高表達可以通過下調靶基因TIMP-1，增強MMP-1，MMP-9的活性減少膠原沉積而減弱心室重構。

2.6miR-132 周細胞對血管成熟的調節起關鍵性作用。Katare等〔30〕研究表明，大隱靜脈源性周細胞祖細胞(SVPs)通過上調miR-132來參與心臟修復。甲基化CpG結合蛋白(MeCP)2可以促進纖維化和肌成纖維細胞分化。通過結扎左前降支冠狀動脈制作小鼠心肌梗死模型，經SVPs移植后發現小鼠梗死邊緣區面積為25.4%(對照組32.3%)，心臟間質纖維化顯著降低，MeCP2表達顯著下降；而SVPs轉染miR-132抑制劑后再移植入心臟，小鼠心肌梗死后的纖維化加重。在隨后的體外實驗中發現經SPV培養液培養的心肌成纖維細胞增殖能力減弱，向肌成纖維細胞分化的能力降低，并且MeCP2的表達減少。敲除miR-132的心肌成纖維細胞經SVPs培養液培養后，發現其抗纖維化的能力減弱了，因此MeCP2被看作為miR-132的一個直接靶點。miR-132是通過調節MECP2來參與纖維化過程。

2.7miR-214 近年來的研究表明miR-214與心血管疾病有關，而大多數研究集中在miR-214與心肌細胞之間的作用方面，如miR-214通過EZH2基因表達的負調節作用參與心肌肥厚的調控〔31〕；外分泌體是細胞間免疫信號傳導、應激反應及血管再生的重要介質。內皮細胞釋放的含miR-214外泌體能夠抑制毛細血管擴張性共濟失調基因突變,從而防止衰老,使血管再生〔32〕。Dong等〔33〕研究結果表明miR-214在急性心肌梗死6 h的大鼠心肌中的梗死區及邊緣區表達均上調。Lv等〔34〕證實miR-214在培養乳大鼠心肌細胞中的表達隨過氧化氫(H2O2)濃度的增加而上升，miR-214通過對PTEN的調節降低心肌細胞凋亡。而對于miR-214是否參與心肌纖維化研究較少，目前只有一篇文獻〔35〕提到miR-214參與心肌纖維化，Arin制作小鼠缺血再灌注心肌梗死模型，再灌注損傷7 d后取心臟標本做 Masson三色染色，結果表明對照組心臟的纖維化面積較小，而敲除miR-214組心臟的纖維化面積顯著增大，而作者對miR-214在纖維化中的作用及機制未做進一步的研究。

綜上，心肌梗死或持續高血壓所造成的心肌纖維化在臨床上仍然是一個主要的難題。而miRNAs參與調節纖維化提示了新的治療思路。miRNAs可通過多個基因調節心臟纖維化，這些基因包括磷酸酶和張力蛋白同族體，TGF-β，膠原蛋白，MeCP2和鈉鈣交換體(NCX)1〔36，37〕。在miR基因調控水平，使用特定的miR模擬物和抑制劑有望成為一個治療或減輕缺血后的心臟纖維化和心力衰竭的有效方法。然而，這種潛在的療法雖然目前引起許多關注但miRs之間相互作用復雜，應用于臨床還有漫長的路途。因此，在應用miRs阻止纖維化之前對于它們與纖維化發展過程及靶基因的關系、作用機制充分的理解是十分必要的。

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〔2016-08-11修回〕

(編輯 王一涵)

R329.4

A

1005-9202(2017)22-5720-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.105

河北省自然科學基金資助項目(No.H2015206440)

邵素霞(1966-)，女，碩士生導師，主要從事心臟形態學及病理學研究。

張莉絲(1985-)，女，碩士，主治醫師，主要從事心臟形態學及病理學研究。