低氧對前列腺間質細胞活性氧、低氧誘導因子-1α、雄激素受體表達的影響及依達拉奉的干預作用

李曉娜 任海林 陳國俊 李 寧 侯 智 索吉明

(青海省人民醫院分子病理實驗室，青海 西寧 810007)

低氧對前列腺間質細胞活性氧、低氧誘導因子-1α、雄激素受體表達的影響及依達拉奉的干預作用

李曉娜 任海林1陳國俊1李 寧1侯 智1索吉明1

(青海省人民醫院分子病理實驗室，青海 西寧 810007)

目的探討低氧環境下活性氧(ROS)在前列腺增生中的作用及依達拉奉對其的干預作用。方法流式細胞儀檢測前列腺增生組織及原代培養細胞中ROS的表達，低氧條件下觀察前列腺間質細胞ROS及生長變化，熒光定量PCR法檢測低氧誘導因子(HIF)-1α、雄激素受體(AR)的變化。低氧條件下用依達拉奉干預后，檢測細胞生長及ROS、HIF-1α、AR的變化。結果前列腺增生組織及3%O2條件下細胞ROS均明顯升高(P<0.01)，3%O2條件下細胞增殖升高(P<0.01)；HIF-1α、AR表達上調(均P<0.05)；在3%O2條件下依達拉奉干預后，ROS明顯降低(P<0.01)，HIF-1α明顯下調(P<0.05)；細胞增殖明顯下降(P<0.01)。結論低氧及低氧環境刺激產生的ROS在前列腺增生中可能起關鍵作用。

低氧；活性氧；低氧誘導因子-1α；雄激素受體；前列腺增生

局部缺氧和炎癥反應是前列腺增生兩大病因學說〔1〕，活性氧(ROS)是兩大病因學說中的關鍵因子。低氧誘導因子(HIF)-1α是缺氧條件下調節氧穩態平衡的重要因子，雄激素受體(AR)是前列腺細胞增殖的重要基因。本文探討ROS、HIF-1α、AR在前列腺增生的發生發展中的角色。

1 材料與方法

1.1前列腺間質原代細胞 人前列腺間質細胞取自經尿道前列腺電切組織，年齡67～86(平均72.5)歲，并經病理證實為良性前列腺增生。對照組年齡37～46(平均43.5)歲，為男性膀胱癌患者6例，在膀胱癌手術過程中取其少量前列腺組織，經病理證實排除前列腺增生和前列腺癌。患者均簽署知情同意書。

1.2試劑、藥物及儀器 熒光探針Carboxy-H2-DCFDA(Invitrogen公司)，AnnexinⅤ FITC/PI凋亡及增殖檢測試劑盒(Beckman Coulter公司)，HIF-1α、AR的引物和熒光探針以及內參GAPDH均為ABI公司訂購的商用成品。氧自由基清除劑依達拉奉(南京森貝伽生物科技有限公司，純度>98.5%，批號89-25-8)。SQP-100S三氣培養箱(天津瑪福爾科技有限公司)，HT7900熒光定量PCR儀(ABI公司)，流式細胞儀(Beckman Coulter公司)。

1.3前列腺間質原代細胞培養、鑒定及細胞內ROS檢測 按照原代培養的標準方法處理組織〔2〕后，置于37℃，21%O2，5%CO2培養箱中培養并傳代，取生長良好的傳代細胞爬片。根據取材前治療分為兩組：經5α-還原酶抑制劑治療和未經5α-還原酶抑制劑治療組，機械法粉碎增生前列腺組織后，用300目尼龍網過濾細胞得到單細胞懸液。按照文獻報道方法〔3〕用無血清培養液稀釋Carboxy-H2-DCFDA探針終濃度為10 μmol/L，待檢測細胞去除細胞培養液，加入適當體積稀釋好的探針，37℃細胞培養箱內孵育30 min，離心細胞并收集，以磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，上流式細胞儀檢測。兩種組織激發光均為氬離子激光488 nm譜線，使用儀器自帶的CellQest軟件分析平均熒光強度。

1.4流式細胞儀檢測培養細胞凋亡和增殖 按照凋亡、增殖檢測試劑盒操作說明要求處理細胞后，上流式細胞儀檢測培養細胞凋亡率和細胞增殖活性，WinMDI軟件分析數據。

1.5低氧條件下觀察前列腺間質細胞及ROS變化 取原代培養的前列腺間質細胞第5～7代細胞進行，將生長良好的細胞按氧濃度分組：細胞低氧培養用SQP-100S三氣培養箱，分別在3%O2，1%O2濃度下培養48 h，對照在21%O2下培養。按前述方法檢測各組細胞ROS、增殖活性和凋亡變化，HT7900熒光定量PCR儀檢測HIF-1α、AR mRNA變化。檢測方法為相對定量分析2-△△Ct法。HIF-1α、AR的引物和熒光探針以及內參GAPDH均為ABI公司訂購的商用成品，反應條件及操作均按照試劑盒說明進行。每個樣品每次試驗至少設立3個重復，重復3次試驗。

1.6依達拉奉干預對前列腺間質細胞ROS、細胞生長及HIF-1α、AR mRNA表達的影響 3%O2濃度下培養細胞，依達拉奉干預濃度為50、80 μmol/L。對照組予同劑量生理鹽水。流式細胞儀檢測各組ROS及細胞生長情況。熒光定量PCR法檢測HIF-1α、AR mRNA。

1.7統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組ROS比較 免疫組化結果顯示原代培養的人前列腺間質細胞經5～7代后，其成分主要為平滑肌細胞及成纖維細胞，符合前列腺間質細胞的組織學特點。前列腺增生組織勻漿中ROS濃度〔(82.727±15.923)%〕較正常前列腺組織勻漿明顯升高〔(40.947±10.079)%,t=10.732,P<0.01〕，但21%O2培養細胞中ROS濃度明顯下降〔(31.680±11.079)%,t=-6.521,P<0.01〕。經5α-還原酶抑制劑治療和未經5α-還原酶抑制劑治療的前列腺組織中ROS濃度無統計學意義〔(84.527±13.774)%、(82.727±15.923)%，t=2.032，P>0.05〕。3%O2培養后細胞ROS較21%O2明顯增高〔(84.094±10.994)%，P<0.01〕，依達拉奉干預可以降低ROS水平〔(37.380±9.986)%,t=-19.188,P<0.01〕。

2.2細胞增殖、凋亡情況 與21%O2培養〔(15.193±1.446)%〕相比，3%O2培養條件下細胞處于增殖期，G2/S期比例增多〔(21.267±2.866)%,t=7.809,P<0.01〕；依達拉奉干預則可降低G2/S期比例〔(18.362±1.681)%,t=3.523,P<0.01〕。與3% O2培養〔(2.685±0.35)%〕相比，1%O2細胞凋亡增加〔(27.919±4.249)%,t=-23.458,P<0.01〕，依達拉奉干預可上調細胞凋亡率〔(12.657±1.400)%,t=24.783,P<0.01〕。

2.3依達拉奉干預對前列腺組織間質細胞ROS、增殖及HIF、AR mRNA的影響 與對照組細胞ROS水平〔(82.727±15.923)%〕比較，80 μmol/L依達拉奉可以明顯降低ROS水平〔(39.569±11.271)%，t=13.423,P<0.01〕，50 μmol/L依達拉奉組ROS水平無明顯變化〔(80.716±14.812)%，t=1.746,P>0.05〕。與對照組細胞增殖率〔(21.267±2.866)%〕比較，80 μmol/L依達拉奉組細胞增殖明顯下降〔(18.362±1.681)%，t=3.523,P<0.01〕。80 μmol/L依達拉奉組HIF-1α mRNA表達(2.657±0.413)較對照組明顯下降(2.828±0.318，t=2.708,P<0.05)，而AR mRNA表達(2.155±0.373)與對照組無統計學差異(2.335±0.443，t=2.040,P>0.05)。

3 討 論

前列腺增生的病因有許多學說，但公認的只有兩點：老化和有功能的睪丸。但目前用于抗雄激素治療的兩類5α-還原酶抑制劑并不能阻止前列腺增生的臨床進展，本研究檢測經5α-還原酶抑制劑治療和未經5α-還原酶抑制劑治療的前列腺組織中ROS的變化無差異。相關研究也發現，經過和未經過5α-還原酶抑制劑治療患者其前列腺組織中炎癥細胞的表達也是無差別的〔4〕。前列腺增生是一種公認的老化性疾病，ROS在老化中的作用也日益受到重視〔5〕，但目前從老化角度研究前列腺增生的文獻較少。有理由認為在老化因素作用下，前列腺局部微環境變化，導致了前列腺的第2次“發育”，但其關鍵的啟動因素有待進一步研究。老化的典型改變包括局部血管老化而繼發的損害，并由此導致局部缺血和低氧，研究已經證實低氧在一定條件下可以刺激增殖〔6〕，因此我們推測低氧刺激可能就是前列腺增生的初始原因之一。低氧可以通過線粒體黃嘌呤氧化酶、吞噬細胞、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)等途徑產生大量ROS〔7〕。本研究發現前列腺組織勻漿中ROS濃度明顯升高，但培養細胞中ROS濃度明顯下降，可能與培養細胞是在常氧條件下有關。研究發現在適度的ROS刺激下，細胞開始增殖并同時表達DNA修復因子和抗氧化酶〔8〕。盡管不同組織來源的細胞對ROS反映的濃度是不一致的，但共同的一點是：低濃度刺激細胞生長，高濃度導致細胞凋亡或者死亡〔6〕。ROS本身或者進一步激活其他增殖、凋亡相關基因，可能導致細胞增殖或者凋亡，除涉及ROS本身的濃度和類別外，還涉及不同的細胞類型、密度、信號傳導通路、DNA表達和酶激活等方面。HIF-1α是缺氧條件下廣泛存在于人體內的一種調節氧穩態平衡的重要因子，HIF-1α可以進一步啟動下游一系列生長調控基因，使得機體適應低氧，并在低氧環境下繼續生長發育，在許多腫瘤研究中已經證實。AR激活后可以啟動、明顯促進前列腺細胞的增殖〔9〕。本研發現在低氧刺激后，前列腺間質細胞HIF-1α、AR mRNA表達明顯上調，前列腺間質細胞處于增殖期。而當依達拉奉干擾ROS后，前列腺間質細胞的HIF-1α mRNA表達下調，盡管AR mRNA無明顯變化，但前列腺間質細胞生長受到抑制。ROS與HIF-1α、AR及依達拉奉的相互關系仍需進一步研究。局部炎癥反應在前列腺增生的中的作用日益受到重視〔1〕，炎癥刺激可以通過白細胞內NADPH途徑產生大量ROS〔10〕。本研究發現適度的ROS可以刺激前列腺間質細胞增殖，依達拉奉干預ROS后，細胞增殖下降，并出現凋亡增加。因此，低氧環境刺激產生的活性氧在前列腺增生可能起關鍵作用，提示改善局部缺氧狀態和抑制局部ROS可能是前列腺增生治療的新方向。

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R697+.32

A

1005-9202(2017)24-6021-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.007

青海省自然科學基金(No.2012-Z-939Q)

1 青海大學附屬醫院泌尿外科

任海林(1973-)，男，博士，副主任醫師，主要從事泌尿系統相關疾病研究。

李曉娜(1978-)，女，碩士，副主任技師，主要從事高原醫學基礎研究。

〔2016-01-11修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)