利用CRISPR/Cas9技術構建miRNA-29b1基因敲除小鼠

趙 勇，師長宏，趙 亞，辛智倩，劉佩娟，張彩勤，白 冰，白杰英，王 華，張 海

(1.第四軍醫大學實驗動物中心，西安 710032;2.軍事醫學科學院實驗動物中心，北京 100071; 3.安徽醫科大學第一附屬醫院腫瘤科，合肥 230022)

研究報告

利用CRISPR/Cas9技術構建miRNA-29b1基因敲除小鼠

趙 勇1，師長宏1，趙 亞1，辛智倩1，劉佩娟1，張彩勤1，白 冰1，白杰英2，王 華3，張 海1

(1.第四軍醫大學實驗動物中心，西安 710032;2.軍事醫學科學院實驗動物中心，北京 100071; 3.安徽醫科大學第一附屬醫院腫瘤科，合肥 230022)

目的應用CRISPR/Cas9技術構建miRNA-29b1基因敲除小鼠。方法針對miRNA-29b1基因設計一段sgRNA，sgRNA和Cas9體外轉錄后顯微注射至C57BL/6小鼠受精卵細胞。小鼠出生后取其基因組DNA進行測序以鑒定基因型，同時取小鼠心、肝、脾、肺、腎等臟器研磨后提取總RNA，通過real-time PCR分析miRNA-29b1在這些臟器中的表達。結果設計了20 bp的miRNA-29b1sgRNA并與Cas9一起進行了體外轉錄，顯微注射小鼠受精卵細胞后獲得miRNA-29b1基因突變小鼠。測序結果表明突變小鼠有兩種基因型，一種為10 bp的缺失突變;另一種為22 bp的缺失突變，同時伴有3 bp的插入突變。與野生型小鼠相比，基因突變小鼠心、肝、脾、肺、腎等組織中miRNA-29b1表達量下降明顯。結論應用CRISPR/Cas9技術成功構建miRNA-29b1基因敲除小鼠。

CRISPR/Cas9;miRNA-29b1;基因敲除小鼠

在前期的研究中本課題組通過動物實驗不僅發現miRNA-29b1在酒精肝中表達改變，而且觀察到miRNA-29b1影響血管內皮細胞功能，其機制可能是miRNA-29b1提高血管內皮細胞通透性參與動脈粥樣硬化的病理過程［5］。由于酒精性肝纖維化對人危害大，目前尚無有效方法對其預防和治療，同時鑒于miRNA-29b1在酒精性肝損傷肝纖維化發病中的機制不明，本研究擬以CRISPR/Cas9技術敲除 C57BL/6小鼠中 miRNA-29b1基因，以研究miRNA-29b1基因在酒精性肝損傷及纖維化中功能。

1 材料和方法

1.1 動物及試劑

SPF級C57BL/6小鼠，4～6周齡，由第四軍醫大學實驗動物中心提供(許可證號SCXK(軍)2012 -0007)，6～8周齡 ICR小鼠購自于北京維通利華公司，兩種小鼠均飼養于屏障級設施。RNA體外轉錄試劑盒及純化試劑盒購自于 Ambion公司。sgRNA體外轉錄試劑盒由北京唯尚立德生物科技有限公司提供。Bbs I限制性內切酶購自于NEB公司，T4 DNA連接酶、dNTPs購自于 TaKaRa公司。pX330質粒由北京艾德摩公司饋贈。小鼠基因組DNA提取試劑盒由成都嘉誠生物科技有限公司提供，PCR產物純化試劑盒購自于天根生物公司。

1.2 sgRNA設計及重組質粒構建

根據 Genbank上報道的小鼠 miRNA-29b1序列，將待敲除序列利用http://crispr.mit.edu網站進行分析，設計20 bp的sgRNA靶向序列(圖1，大寫為miRNA-29b1成熟區序列，涂紅序列為PAM區)。以此為依據，合成一對引物 (mir29b-pX330-F: CACCgaggaagctggtttcatatgg，mir29b-pX330-R: AAACccatatgaaaccagcttcctc)進行重組質粒構建。各取2 μL上下游引物，以水補齊至20 μL，95℃ 作用5min進行退火，pX330質粒Bbs I單切后回收，退火產物以T4連接酶克隆至pX330質粒。

圖1 sgRNA設計Fig.1 Diagram of sgRNA design

1.3 sgRNA和Cas9體外轉錄及純化

幾年前，我贏得了《洛杉磯時報》夏季攝影比賽的冠軍，并開始接觸國際攝影記者。住在越南會安時，我開啟了自己的個人項目，我覺得每個攝影師都需要有自己的拍攝項目。

以上述pX330重組質粒為模板，通過含T7啟動子的上下游引物(mir29b-3at-F:tTAATACGACT CACTATAGGgaggaagctggtttcatatggG，mir29b-3at-R:A AAAgcaccgactcggtgc)進行 PCR反應克隆 sgRNA基因序列，sgRNA基因序列以體外轉錄試劑盒進行轉錄、純化。同時以pX330質粒為模板，通過PCR反應克隆Cas9基因，PCR產物純化后進行體外轉錄，轉錄方法按試劑盒說明書進行。RNA轉錄產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定后-80℃保存備用。

1.4 顯微注射及受精卵細胞移植

雌性C57BL/6小鼠超數排卵后收集受精卵細胞。Cas9和sgRNA轉錄產物按2∶1比例混合，稀釋后使其終濃度含100 ng/μL的Cas9和50 ng/μL的sgRNA。以Eppendorf TransferMan NK2顯微操作裝置將上述混合物注入收集的受精卵細胞胞質。注射后的受精卵細胞37℃培養2 h后移植到假孕的ICR母鼠。

1.5 敲除小鼠基因型鑒定

剪取出生1周新生小鼠尾巴，加入消化液后65℃作用30min進行小鼠基因組DNA提取，具體提取方法按試劑盒說明書進行。取 100 ng基因組DNA進行PCR反應以鑒定小鼠基因型。PCR反應條件為98℃預變性3 min，98℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃20 s，72℃ 3 min，共30個循環。

1.6 Real time PCR鑒定miRNA-29b1在敲除小鼠體內的表達

頸椎脫臼法處死小鼠，取心、肝、脾、肺、腎等組織勻漿后提取總 RNA，反轉錄后以 Real time PCR進行 miRNA-29b1表達檢測。cDNA合成引物為GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAC CAGAGCCAACtaaacc，Real time PCR反應上游引物GATCgctggtttcatatggtgg，下游引物 GTGCAGGGTCC GAGGT。

2 結果

2.1 sgRNA及Cas9體外轉錄

以pX330重組質粒為模板，sgRNA上下游引物進行擴增反應，可得到大小約為120 bp的PCR產物(圖2A)，同時通過 Cas9引物也可擴增到4 200 bp的PCR產物(圖2B)。上述兩種PCR產物純化后在T7啟動子介導下進行體外轉錄反應，轉錄產物經紫外分光光度計檢測后 OD260/280＞1.9，OD260/230＞2.0。

2.2 miRNA-29b1敲除小鼠基因型鑒定

注射sgRNA及Cas9 mRNA的小鼠受精卵細胞移植受體ICR小鼠后，獲得F0代首建鼠，F0代突變小鼠與野生型C57BL/6小鼠交配，獲得F1代小鼠，F1代突變小鼠互交后獲得兩種基因型純合子小鼠。提取小鼠基因組DNA進行測序鑒定，結果發現F0代有兩種基因型，一種是10 bp缺失突變;另一種是22 bp缺失突變，同時伴有3 bp插入突變。兩種基因型突變均發生在 miRNA-29b1序列成熟區(圖3)。

圖2 sgRNA及Cas9 PCR產物A:sgRNA PCR產物 B:Cas9 PCR產物Fig.2 PCR product of the sgRNA and Cas9

圖3 miRNA-29b1敲除小鼠基因型Fig.3 Genotype of the miRNA-29b1knockout mice

2.3 miRNA-29b1在敲除小鼠體內表達

取F2代純合子小鼠的心、肝、脾、肺、腎等組織，勻漿后提取細胞總 RNA，反轉錄后以 real-time PCR進行分別檢測miRNA-29b1在上述臟器中的表達。結果如圖4所示，與野生型 C57BL/6小鼠相比，miRNA-29b1在F2代純合子小鼠心、肝、脾、肺、腎等組織中的表達明顯下降，表明成功構建miRNA-29b1基因敲除小鼠。

3 討論

CRISPR/Cas9是細菌和古細菌為應對病毒和質粒不斷攻擊而演化來的獲得性免疫防御機制。在這一系統中，crRNA通過堿基配對與tracrRNA結合形成雙鏈 RNA，此tracrRNA/crRNA二元復合體指導Cas9蛋白在crRNA引導序列靶定位點切斷雙鏈DNA［7］。在基因組編輯過程中，tracrRNA和 crRNA可以融合成為1條具有靶向作用的RNA(sgRNA)表達，該 sgRNA同樣可以起到靶向剪切的作用。CRISPR/Cas9的優點是操作簡單，對基因組的效率高，需要對某一個靶位點編輯的時候，只需要表達相應的sgRNA即可，不需要對Cas9核酸酶進行改造，它可對任何物種的基因組進行高效率的定向編輯［8］。本研究中我們體外合成一條 sgRNA，該sgRNA具有良好的靶向作用，可引導Cas9蛋白發揮核酸酶作用，在特定的PAM區上游對miRNA-29b1進行定向編輯。sgRNA和Cas9轉錄產物注射供體小鼠受精卵細胞后，共得到33只F0代小鼠，測序結果表明9只小鼠miRNA-29b1基因發生缺失突變，陽性率為27%，明顯高于ES細胞打靶技術，由此證明CRISPR/Cas9技術是一個簡單、高效的基因編輯工具，可用于基因修飾動物研究。

miRNA-29家族中各個成員序列高度同源，僅有2～3個主要位點有所不同。miRNA-29a和miRNA-29c均含有22個核苷酸，二者之間僅5’端的第10個核苷酸不同;miRNA-29b含有23個核苷酸，與miRNA-29a/c不同的是，miRNA-29b的3’端具有AGUGUU序列，該序列具有核定位作用，因此miRNA-29b主要位于細胞核［9］。miRNA-29序列的特殊性決定各個成員具有不同的生物學功能，miRNA-29a/b1與某些疾病的發生有關，而miRNA-29b2/c與免疫反應和調節相關。CCl4肝纖維化小鼠模型miRNAs表達譜結果顯示有31種miRNAs表達發生變化，miRNA-29家族表達減少，其中miRNA-29b下降最為顯著，而在正常肝組織中 miRNA-29b高表達，提示 miRNA-29b可能與肝纖維化疾病有關［10］。miRNA-29b1在多種器官纖維化的調控中發揮著重要作用，研究表明 TGF-β1可下調 miRNA-29b1表達，減輕其對 TGF-β1/Smad信號通路的抑制作用，最終導致纖維化的發生［11］。這提示我們如果敲除miRNA-29b1基因后，纖維化發生時間會提前，纖維化發生程度可能會加重，因此通過敲除miRNA-29b1基因復制酒精性肝纖維化動物模型可克服以往動物模型的缺點。本研究構建的miRNA-29b1基因敲除小鼠，將為酒精性肝纖維化提供良好的動物模型，尤其對研究miRNA-29b1在酒精性肝纖維化發病機制提供良好的研究條件。

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Construction of miRNA-29b1 knockout mice based on CRISPR/Cas9 technology

ZHAO Yong1，SHI Chang-hong1，ZHAO Ya1，XIN Zhi-qian1，LIU Pei-juan1，ZHANG Cai-qin1，BAI Bing1，BAI Jie-ying2，WANG Hua3，ZHANG Hai1
(1.Laboratory Animal Center，The Fourth Military Medical University，Xi’an 710032，China; 2.Laboratory Animal Center，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071; 3.Department of Oncology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022)

ObjectiveTo construct miRNA-29b1 gene knockout mice based on CRISPR/Cas9 technology.MethodsTo design and synthesize sgRNA according to the miRNA-29b1 sequence in Genbank.sgRNA and Cas9 were transcribed to RNA in vitro，these RNA were then microinjected into zygotes of C57BL/6 mice.After mouse birth，the genome DNA was extracted and sequenced to identify its genotype;meanwhile，real-time PCR was used to assay the expression of miRNA-29b1 in the heart，liver，spleen，lung and kidney of mutated mice.ResultA 20 bp sgRNA targeted on miRNA-29b1 was synthesized and transcribed to RNA with Cas9.After microinjection，miRNA-29b1 gene-mutated mice were obtained.The sequencing results showed that there were two types of genotype for the mutated mice，one was 10 bpdeletion，and another was 23 bp deletion accompanied with a 3 bp insertion.Compared with the wild-type mice，the expression of miRNA-29b1 in the heart，liver，spleen，lung and kidney was reduced significantly.ConclusionsmiRNA-29b1 gene knockout mice are constructed successfully by using CRISPR/Cas9 technology.

CRISPR/Cas9;miRNA-29b1;Gene knockout mice

R-33

A

1671-7856(2016)12-0001-04

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.12.001

2016-05-13

國家自然科學基金優秀青年基金項目(NO.81522009);國家自然科學基金面上項目(NO.8137257，81272385);軍隊重點項目(NO.BWS14J058)。

趙勇(1984-)，男，碩士研究生，專業:動物模型。E-mail:zhaoyong8@aliyun.com。

張海(1971-)，男，副教授，研究方向:動物模型。E-mail:hzhang@fmmu.edu.cn.王華(1978-)，男，教授，研究方向:肝損傷與修復。E-mail:wanghua@ahmu.edu.cn。