miRNA-29b在急性冠脈綜合征病人中的表達水平及意義

陸 爽，李 艷，鄧 虹，林 昕，張明謙

miRNA-29b在急性冠脈綜合征病人中的表達水平及意義

陸 爽，李 艷，鄧 虹，林 昕，張明謙

目的 探討miRNA-29b在急性冠脈綜合征病人中的表達水平及意義。方法 選取2013年2月—2014年3月在昆明醫科大學附屬延安醫院急診醫學科及心血管內科確診的急性冠脈綜合征病人58例，其中急性心肌梗死(AMI)30例為觀察組，不穩定型心絞痛(UA)28例為對照組。同時選取健康體檢者10名作為正常組。發病后不同時間點位采用微小RNA提取試劑盒對各組觀察對象血漿中RNA進行提取，應用RT-PCR及qRT-PCR方法對miRNA-29b表達水平進行檢測，比較各組表達差異；結合各組對象血清細胞外基質(ECM)含量、增強MRI(DE-MRI)結果、心律失常發生情況等闡述其意義。結果 發病后1 d、7 d、14 d和30 d，觀察組血漿中miRNA-29b表達水平顯著低于對照組(P<0.05)，觀察組和對照組miRNA-29b表達水平均顯著低于正常組(P<0.05)；觀察組和對照組相比較其心肌纖維化發生、心律失常發生均顯著增高(P<0.05)。結論 miRNA-29b表達水平與急性冠脈綜合征后心肌纖維化及心律失常的發生具有密切關系。

急性冠脈綜合征；微小RNA；心肌纖維化；心律失常

急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)是在冠狀動脈粥樣硬化的基礎上，危險因子等多因素作用下出現粥樣斑塊破裂出血，最終導致血栓形成并堵塞管腔，表現以胸痛、休克為臨床特征的一組臨床綜合征，通常分為急性心肌梗死(AMI)和不穩定型心絞痛(UA)兩種類型[1]。急性冠脈綜合征發生后易發生心律失常及心功能急劇惡化。據統計，目前盡管冠心病二級預防藥物已廣泛應用于臨床，但每年依然有4%～5%的急性冠脈綜合征病人因發生心律失常或者心功能惡化而死亡[2]。近年來研究發現心律失常和心功能進行性惡化與心肌纖維化形成有著密切關系，其中miRNAs在心肌纖維化形成過程中起著重要的調節作用[3]。本研究針對不同類型的急性冠脈綜合征病人miRNA-29b表達水平進行檢測、結合心肌纖維化血清標準物(血清細胞外基質)含量測定、增強MRI(DE-MRI)結果、心律失常發生情況等臨床資料評價其意義，為改善急性冠脈綜合征的預后提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年2月—2014年3月在昆明醫科大學附屬延安醫院急診醫學科及心血管內科確診的急性冠脈綜合征病人58例，男性38例，女20例，年齡(58.1±6.45)歲。其中AMI 30例為觀察組，UA 28例為對照組。納入標準：所有急性冠脈綜合征病人診斷參照2012年ESC ST抬高急性心肌梗死管理指南和2012年中華醫學會非ST抬高急性冠脈綜合征診斷與治療指南診斷標準納入，觀察組及對照組均按照指南推薦給予治療。所有入選個體參與試驗均符合倫理學規定。病例排除標準：有近期手術、創傷、腫瘤、急性感染、先天性心臟病、心肌病、嚴重肝腎功能不全、類風濕性關節炎，腦血管意外等疾病[2]。選取健康體檢者10名為正常組，男性5名，女性5名，年齡(59.3±5.62)歲。正常組來自昆明市延安醫院健康體檢者，滿足臨床資料及影像學檢查無器質性病變，且血糖、血脂正常。

1.2 主要試劑 microRNA快速提取試劑盒(購自北京博凌科為生物科技公司，編號110501)；逆轉錄聚合酶鏈反應試劑盒采用Promega反轉錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應試劑盒采用Takara BIO株式會社熒光定量試劑盒(購自上海拜力生物科技有限公司)；Ⅰ型、Ⅲ型前膠原放免試劑盒和層粘蛋白(LN)和透明質酸(HA)放免試劑盒(均購自上海信裕生物科技有限公司)

1.3 試驗方法

1.3.1 miRNA-29b表達檢測 觀察組和對照組研究對象分別在確診ACS后1 d、7 d、14 d和30 d，應用全血(液體樣本)microRNA快速提取試劑盒抽取外周靜脈血標本(10～20) mL，根據產品說明書步驟，進行全血微小RNA提取。提取完畢后用普通瓊脂糖凝膠電泳(電泳條件：膠濃度1.2%；0.51)TBE電泳緩沖液；150 V，15 min)進行RNA完整性檢測。用OD260/OD280比值檢測純度檢測。檢測完畢后應用逆轉錄PCR試劑盒進行逆轉錄處理，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應試劑盒對miRNA-29b表達水平進行定量檢測。

1.3.2 血清細胞外基質(ECM)含量檢測 試驗組及對照組分別在發病后30 d采集晨起空腹靜脈血10 mL，轉速800 r/min離心15 min，靜置分離血清，置于-20℃低溫冰箱中放置備用。血清細胞外基質(ECM)檢測包含Ⅰ型前膠原(PCⅠ)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、LN、HA。各檢測成分按標準步驟進行加樣、4℃放置過夜后加入分離劑、3 500 r/min離心20 min棄上清后加入放射沉淀物，采用放射免疫測定法進行檢測各成分濃度。

1.3.3 心肌增強MRI(DE-MRI)檢測及心律失常發生情況監測 各組在不同時間點位進行心肌對比劑延遲增強MRI(DE-MRI)檢測了解心肌纖維化情況，應用計算機輔助測體積法(CAVM)對纖維化范圍進行測定。各組應用24 h動態心電圖對心律失常發生情況進行監測。

2 結 果

2.1 總RNA完整性測定及熒光定量PCR產物測定 瓊脂糖凝膠電泳檢測提取總RNA完整性(見圖1)，檢測結果28 s，18 s ，5 s條帶清晰完整、無擴散現象，用紫外分光光度計測定260 nm和280 nm下的吸光度，結果顯示OD260/OD280在1.8～2.0，表明RNA完整并具有較好的純度，滿足實驗要求。

圖1 總RNA瓊脂糖電泳圖

2.2 各組miRNA-29b表達水平對比 觀察組發病后1 d、7 d、14 d和30 d的血清miRNA-29b表達水平均顯著低于對照組(P<0.05)；觀察組與對照組發病后1 d、7 d、14 d和30 d的血清miRNA-29b表達水平顯著低于正常空白組(P<0.05)。詳見表1。

2.3 各組血清細胞外基質(ECM)含量檢測 應用放射免疫測定法對各組血清外基質Ⅰ型前膠原、Ⅲ型前膠原、層粘蛋白和透明質酸進行測定，觀察組血清ECM含量較對照組明顯增高(P<0.05)。詳見表2。

表1 各組不同時間點位血清miRNA-29b表達水平比較(±s)

表2 各組不同時間點位血清ECM含量比較(±s) μg/L

表3 各組不同時間心律失常發生情況比較 %

2.4 心肌增強MRI(DE-MRI)及心律失常發生情況監測 應用心肌對比劑延遲增強MRI(DE-MRI)檢測了解急性冠脈綜合征發生后心肌纖維化情況，觀察組較對照組心肌纖維化發生率增加，急性冠脈綜合征發病后心肌纖維化發生情況與病情嚴重程度相關，且隨疾病時間延長心肌纖維化面積增大(見圖2)。應用24 h動態心電圖檢測觀察組與對照組心律失常發生情況，發現觀察組心律失常發生情況較對照組明顯增加，推測與心肌纖維化有關(P<0.05)。詳見表3。

圖2 各組不同時間點位心肌對比劑延遲增強MRI計算心肌纖維化體積圖

2.5 miRNA-29b與心肌纖維化體積相關關系分析 應用Spearman相關分析對miRNA-29b表達水平與MRI(DE-MRI) 計算機輔助測體積法(CAVM)對纖維化范圍進行相關關系分析(見圖3)，結果相關系數r2=-0.32(P<0.05)。提示miRNA29b與心肌纖維化范圍呈中度負相關關系。

圖3 miRNA-29b表達量與心肌對比劑延遲增強MRI計算心肌纖維化體積相關關系散點圖

3 討 論

目前急性冠脈綜合征嚴重威脅人類健康，發病率及死亡率逐年增高，其發病原因多為急性冠狀動脈狹窄或者突然閉塞，表現為急性心肌缺血為主要特征的臨床綜合征，包括不穩定型心絞痛及急性心肌梗死。在急性冠脈綜合征發生后心律失常和心功能惡化是導致死亡的主要原因。近年來，因持續心肌缺血導致心肌纖維化形成進而誘發心律失常和心功能惡化觀點已被廣泛研究[4]。而眾多的證據表明多種微小RNA(如miR-29、miR-210，miR-302c，miR-185等)參與纖維化形成進程，是調節纖維化形成的關鍵因素之一[5-6]。因此為減少ACS發生后心肌纖維化的發生，避免心臟不良事件發生，改善臨床預后，對ACS病人血清中miR-29b表達水平進行檢測，并結合反應組織纖維化程度的血清細胞外基質(ECM)含量、增強MRI(DE-MRI)結果、心律失常發生情況等臨床資料對其臨床意義進行闡述。

本研究發現，miRNA-29b在急性冠脈綜合征病人血漿中出現了表達下調。同時亦發現miRNA-29b在急性心肌梗死病人中表達下調更為明顯。為明確是否持續心肌缺血后誘發心肌纖維化形成，同時驗證miRNA-29b是否與心肌纖維化形成，采用無創性心肌對比劑延遲增強MRI(DE-MRI)檢測驗證心肌纖維化形成情況，并檢測了血清反映心肌纖維化的生物學指標血清細胞外基質(ECM)含量。結果發現，隨著心肌缺血嚴重程度加重和心肌缺血持續時間的延長，心肌纖維化發生情況明顯增加，且血清細胞外基質含量明顯增高，提示心肌缺血嚴重程度及心肌缺血的持續時間可以導致心肌纖維化的發生，通過Spearman相關分析miRNA-29b與心肌纖維化體積變化情況，發現兩者呈現中度負相關，提示miRNA-29b參與了心肌纖維化的形成。分析其結果可能為持續心肌缺血導致心肌缺氧，而在低氧環境下成纖維細胞可持續性高表達膠原蛋白，產生大量膠原蛋白，其中主要成分包括Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白，同時，低氧環境下可誘導產生TGF-1分泌增加，而TGF-1可通過激活TGF-/Samd信號通路促進Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白沉積，上述變化導致心肌纖維化形成及瘢痕增生[7-8]。而miRNA-29b對于TGF-1有明顯抑制作用[9]，當miRNA-29b低表達時，可以導致其對TGF-1分泌調節失調，從而引起成纖維細胞膠原代謝紊亂，最終導致心肌纖維化形成。研究發現，隨急性冠脈綜合征病人發病后心律失常發生隨心肌纖維化的形成增加，分析其原因是由于心律失常發生與心臟結構重構和電重構密切相關，而心肌纖維化的發生改變了心臟電傳導和興奮，導致心臟興奮性傳導不一致[10]，同時心肌纖維化形成區域異位起搏點興奮性增加，上述原因均導致心律失常發生。

miRNA-29b在急性冠脈綜合征病人血清中表達下調，且與心肌纖維化發生密切相關，誘導心律失常發生。今后有必要進一步研究miRNA-29b的表達情況及其調控機制，對減少急性冠脈綜合征病人心肌纖維化的形成，改善其預后提供實驗室資料。

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(本文編輯王雅潔)

昆明醫科大學附屬延安醫院(昆明 650051)

張明謙，E-mail：gg7944@sina.com

R541.4 R256.2

B

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.24.027

1672-1349(2016)24-2932-04

2016-01-15)

引用信息：陸爽，李艷，鄧虹，等.miRNA-29b在急性冠脈綜合征病人中的表達水平及意義[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2016，14(21)：2932-2935.