復榮通脈膠囊對糖尿病大鼠胸主動脈PAI-1、t-PA表達的影響

崔榮崗，田風勝，蘇 陽，白海龍，邊 云，孟曉峰

復榮通脈膠囊對糖尿病大鼠胸主動脈PAI-1、t-PA表達的影響

崔榮崗，田風勝，蘇 陽，白海龍，邊 云，孟曉峰

目的 觀察復榮通脈膠囊對糖尿病大鼠胸主動脈1型纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)、組織型纖溶酶原激活物(t-PA)表達的影響，探討其對纖溶系統的作用。方法 將Wistar大鼠隨機分為對照組和糖尿病造模組，造模成功大鼠隨機分為模型組、復榮通脈低劑量組(0.7 g/kg)、復榮通脈中劑量組(1.4 g/kg)、復榮通脈高劑量組(2.8 g/kg)，8周后，觀察各組大鼠血糖、血脂水平及胸主動脈PAI-1及t-PA免疫組化表達。結果 造模組大鼠血糖較對照組明顯升高(P<0.05)；胸主動脈PAI-1表達在各造模組較對照組明顯增強(P<0.05)，而在復榮通脈中劑量組、高劑量組表達明顯受抑制；胸主動脈t-PA表達在各造模組較對照組明顯減弱(P<0.05)，在復榮通脈中劑量組、高劑量組其表達明顯增強(P<0.05)。結論 復榮通脈膠囊可抑制PAI-1、促進t-PA在大鼠胸主動脈的表達。

糖尿病；大血管病變；復榮通脈膠囊；1型纖溶酶原激活物抑制劑；組織型纖溶酶原激活物

我國成人糖尿病患病率已升至11.6%[1]，給人們健康造成極大威脅。糖尿病大血管病變發病率居高不下，可導致冠心病、腦卒中、腎功能不全、糖尿病足，嚴重影響糖尿病病人的生活質量甚至預期壽命。纖溶系統功能失衡是大血管病變的重要發病機制之一，且可導致急性心血管事件的發生。

復榮通脈膠囊是益氣活血通絡類中藥復方制劑，用于糖尿病性周圍神經及周圍血管病變的治療，多年臨床應用療效顯著。本研究觀察復榮通脈膠囊對Ⅰ型纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)、組織型纖溶酶原激活物(t-PA)表達的影響，從而探討其防治糖尿病大血管病變的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康雄性Wistar大鼠60只(體重200 g±20 g)，由河北省實驗動物中心提供[動物合格證編號：1405034，單位許可證號：SCXK(冀)2013-1-003]。每籠4只大鼠，自由飲水，定期添加飼料，室溫22 ℃～26 ℃，濕度45%～65%，每日12 h光照維持，晝夜循環。

1.2 實驗儀器 電子天平(日本HM-200)、血糖儀(羅康全活力型)、日本奧林巴斯BX51T-PHD-J11光學顯微鏡及其照相裝置、病理圖文分析系統、病理組織漂烘處理儀、德國Eppendorf-5430離心機、日本HM-200電子天平、德國萊卡RM2015石蠟切片機、江蘇太倉醫用儀器廠DSHZ-300型恒溫水浴箱、德國EPPENDORF移液器、日本三洋MDF-382E型超低溫冰箱、美國Media Cybernetics公司多功能真彩色細胞圖像分析管理。

1.3 實驗用藥及主要試劑

1.3.1 實驗用藥 復榮通脈膠囊，主要組方：地龍、全蝎、黃芪、水蛭、玄參、首烏藤、川牛膝、葛根、穿山龍、甘草、當歸。由河北省滄州中西醫結合醫院中藥制劑室監制生產，由多種中藥粉末組成，每粒膠囊0.5 g，含生藥2 g，按比例加入水制成混懸液。批準文號：冀藥制字Z20070041，生產批號：140310。

1.3.2 主要試劑 鏈脲佐菌素(STZ)：美國Sigma公司，批號S0130；PAI-1免疫組化試劑盒，批號：MB0705；t-PA免疫組化試劑盒，批號：MB0705；北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物模型的建立 60只大鼠，適應性飼養1周。1周后以單純隨機抽樣，采用隨機數字表法選擇10只為正常對照組(NC組)，余50只為造模組。參照文獻方法[2]，造模組大鼠禁食12 h后，一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg(STZ臨用前用0.1 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液配成濃度為1%、pH=4.2的溶液)；正常組腹腔注射等量枸櫞酸鈉緩沖液。72 h后尾靜脈取血測血糖，血糖值≥16.7 mmol/L確定為糖尿病大鼠模型建立，期間大鼠喂標準飼料。穩定1周后列入觀察對象。造模過程中死亡3只，血糖未達標者3只。不成模者棄之不用。

1.4.2 分組與給藥方法 造模成功后大鼠隨機抽取40只，分為模型組(DM)，復榮通脈膠囊低劑量組(FRL)、復榮通脈膠囊中劑量組(FRM)、復榮通脈膠囊高劑量組(FRH)，每組10只。中藥組劑量按人體-大鼠體表面積比值表換算大鼠等效劑量[2]。復榮通脈膠囊低劑量組給予0.7 g/(kg·d)灌胃、復榮通脈膠囊中劑量組給予1.4 g/(kg·d)灌胃、復榮通脈膠囊高劑量治療組給予2.8 g/(kg·d)灌胃，每日灌胃1次，連續8周。正常組和模型組每日給予同等劑量生理鹽水灌胃。實驗期間大鼠自由飲水，喂標準飼料，環境溫度為22 ℃～26 ℃，實驗期間未使用胰島素和其他降糖藥物。

1.4.3 主要觀察指標 大鼠精神狀態、飲水量、尿量、毛色等一般情況；血糖水平；胸主動脈PAI-1及t-PA表達水平；動脈組織鏡下病理形態學改變。

1.4.4 標本的留取 8周后，禁食12 h，大鼠稱重。尾靜脈取血測血糖。以戊巴比妥80 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹部正中切口，腹主動脈采血，離心分離血清，測血糖。留取胸主動脈，置于4%中性福爾馬林溶液中固定，采用免疫組織化學法檢測PAI-1、t-PA。

1.4.5 石蠟切片與免疫組化測定 取實驗組和對照組新鮮動物組織，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，取小于0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm組織塊；用4%多聚甲醛0.1 MPBS，pH7.0～7.6，含0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)固定，給予70%乙醇30 min、80%乙醇30 min、90%乙醇30 min 2次、95%乙醇30 min 2次、100%乙醇30 min 2次、二甲苯透明30 min 2次、55 ℃石蠟中30 min 2次，用銅制模具包埋組織；將厚度3 μm～5μm組織切片附于經多聚賴氨酸附膜置載玻片上，60 ℃烘烤過夜；將切片浸于二甲苯中5 min 2次、100%乙醇5 min 2次、95%乙醇5 min 2次、90%乙醇5 min 2次、85%乙醇5 min 2次、75%乙醇5 min 2次、自來水沖洗、PBS沖洗2次；1%甲醇過氧化氫，室溫10 min，蒸餾水沖洗1次，0.1 mol/L PBS沖洗3次，每次5 min；將切片放入0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)中，在微波爐內微波輻射10 min；修復液降至室溫后，0.1 mol/L PBS沖洗3次各5 min；切片上滴正常山羊血清封閉液，室溫20 min，甩掉多余液體，不洗；切片上滴第一抗體，4 ℃過夜，0.1 mol/L PBS洗3次，每次5 min；切片上滴生物素化第二抗體(IgG)，37 ℃20 min，0.1 mol/L PBS洗3次，每次5 min；切片上滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP)，37 ℃20 min，0.1 mol/L PBS洗3次，每次5 min；使用DAB顯色試劑盒1 mL蒸餾水加顯色劑A、B、C各1滴，混勻，加至標本上，顯色6 min，充分水洗；蘇木素復染細胞核1 min，充分水洗、1%鹽酸酒精分化、1%胺水反藍、充分水洗、經70%乙醇5 min、80%乙醇5 min、90%乙醇5 min 2次、95%乙醇5 min 2次、100%乙醇5 min 2次脫水、二甲苯透明5 min 2次、中性樹脂封片；選擇實驗組及對照組陽性和陰性組織，進行100×和400×的顯微照相。

1.4.6 染色結果判定 PAI-1、t-PA的染色陽性表達以細胞質內和(或)細胞膜內出現棕黃色顆粒，強度大于非特異性背景為準，PAI-1、t-PA陽性染色主要分布于動脈平滑肌細胞胞漿內。結果判斷采用方差分析法，IHS=A×B，按陽性細胞面積占總細胞面積比例和染色深度進行評分并分級。A為陽性細胞面積分級：0～1%為0級、1%～10%為1級、10%～50%為2級、50%～80%為3級、80%～100%為4級；B為陽性細胞顯色強度分級：0(陰性)、1(弱陽性)、2(陽性)、3(強陽性)，本實驗以≥2計為陽性。

2 結 果

2.1 實驗動物數量分析 納入實驗觀察47只：NC組10只，DM組9只，FRL組10只，FRM組9只，FRH組9只，符合統計學原則。

2.2 各組大鼠血糖比較 造模前各組大鼠血糖比較，差異無統計學意義(P>0.05)。治療前與NC組比較，DM組及FRL組、FRM組、FRH組大鼠血糖均顯著升高(P<0.05)，DM組及FRL組、FRM組、FRH組間血糖比較，差異無統計學意義(P>0.05)。經灌胃治療8周后，與NC組比較，DM組及FRL組、FRM組、FRH組大鼠血糖，均顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；DM組及FRL組、FRM組、FRH組大鼠血糖比較，差異無統計學意義(P>0.05)；NC組、DM組及FRL組、FRM組、FRH組血糖與治療前比較，差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠血糖比較 mmol/L

2.3 各組大鼠PAI-1比較 與NC組大鼠動脈中有少量表達比較，DM、FRL、FRM、FRH組大鼠動脈中表達明顯增多(P<0.05)。與DM組比較，FRL組表達差異無統計學意義(P>0.05)；FRM組、FRH組表達明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)。與FRL組比較，FRM組表達差異無統計學意義(P>0.05)；FRH組表達明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)。與FRM組比較，FRH組表達差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表2、圖1。

表2 各組大鼠PAI-1比較

NC組 DM組 FRL組 FRM組 FRH組

2.4 各組大鼠t-PA比較 與NC組比較，DM組、FRL組、FRM組、FRH組大鼠動脈中t-PA表達明顯減少(P<0.05)。與DM組比較，FRL組t-PA表達，差異無統計學意義(P>0.05)；FRM組、FRH組t-PA表達明顯增多，差異有統計學意義(P<0.05)。與FRL組比較，FRM組t-PA表達差異無統計學意義(P>0.05)；FRH組t-PA表達明顯增多，差異有統計學意義(P<0.05)。與FRM組比較，FRH組t-PA表達差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表3、圖2。

表3 各組大鼠t-PA比較

NC組 DM組 FRL組 FRM組 FRH組

3 討 論

3.1 纖溶系統異常與動脈粥樣硬化 纖溶酶原激活物(t-PA和u-PA)、血栓調節蛋白共同作用是對抗血栓形成關鍵的生理機制[3]。一旦平衡被打破，就可能導致血栓形成。血管內皮細胞可產生PAI-1。PAI-1是舍平類(serpins)超家族的成員，是t-PA、u-PA主要抑制因子。血漿PAl-1水平在夜間較高、清晨達高峰，故纖溶活性在清晨最低，和缺血所致心血管事件峰值一致[4]。流行病學研究發現，PAI-1水平和活性與胰島素抵抗關系密切，與胰島素抵抗標志物水平呈正相關，故推測PAI-1可能是其組成部分[5]。許多研究已證實，冠心病特別是心肌梗死和不穩定型心絞痛病人血漿PAI-1明顯增高[6]。有研究比較非糖尿病急性心肌梗死病人與年齡相匹配正常人，發現心肌梗死前病人血漿PAI-1活性增高[7]。研究發現，PAI-1濃度增高可預測穩定型心絞痛病人首次心肌梗死的發生[8]。病理研究發現，臨床前期和進展型動脈粥樣硬化病灶中有大量纖維蛋白相關肽，它可能通過刺激血管平滑肌細胞(VSMC)增殖、結合低密度脂蛋白膽固醇及脂蛋白(a)促進斑塊的生長[9]。局部纖溶降低減少纖維蛋白的降解與轉移，纖維蛋白的長期慢性沉積導致血管不斷反復損傷，利于斑塊生長，血流動力學改變及存在湍流部位，這可能是動脈粥樣硬化發生、進展的一個重要原因。

3.2 祖國醫學對糖尿病大血管病變的認識 糖尿病屬中醫“消渴”范疇，其主要病機是陰虛為本，燥熱為標。糖尿病大血管病變屬于消渴變證，由消渴日久所致，而血瘀證貫穿糖尿病大血管病變全過程。病人臨床上多表現為舌質紫暗、有瘀斑，或舌下靜脈曲張，心胸憋悶、刺痛、肢體疼痛、眼底出血等，均屬中醫血瘀證。消渴日久，燥熱耗氣傷陰，導致氣陰兩虛，氣虛則運化無力，水液輸布、運化失調，化為水濕痰濁，氣虛無力推動血行，則血運不暢，加之津血同源，陰虛燥熱，津虧液少，則血行淤滯；痰濕瘀血阻于脈絡，血行不暢，血脈閉阻則發為此病。瘀血是痰濕在氣陰兩虛基礎上產生的病理產物，可阻礙氣機、血行，影響氣血運行，加重氣陰兩虛的程度，進一步導致痰濕、瘀血，加重血脈阻滯的狀態[10]。現代研究認為內皮功能損傷的中醫病機屬血瘀，并且通過活血化瘀的中醫藥治療可改善血管內皮細胞的功能和動脈粥樣硬化。因此，氣陰兩虛，瘀血阻滯是糖尿病大血管病變發生、發展的主要機制，益氣養陰活血則成為糖尿病大血管病變的基本治療理論與方法[11]。

3.3 復榮通脈膠囊組方、藥理作用、研究進展 復榮通脈膠囊為滄州中西醫結合醫院院內中藥復方制劑，含地龍、全蝎、黃芪、水蛭、玄參、首烏藤、川牛膝、葛根、穿山龍、甘草、當歸，有益氣活血通絡之效。開發之初用于周圍血管病變。現代藥理對中藥研究發現，復榮通脈膠囊組方中大多數藥味具有抗凝、抗氧化、降脂、降糖、改善循環的作用。水蛭素是水蛭體內起抗凝作用的主要活性成分，使凝血酶失去裂解纖維蛋白能力，阻止凝血酶催化凝血因子活化[11]，并有報道稱水蛭有防止血栓形成和延伸的作用[12]。地龍具有抗氧化、改善循環功能[13]。Wu等[14]研究表明，黃芪多糖有較好對抗氧化損傷和保護血管內皮細胞的功能。太子參具有抗氧化、降糖、降脂[15]的作用。實驗發現，牛膝中的牛膝多糖有抗凝作用[16]，牛膝總皂苷有血管舒張作用[17]。葛根是近幾年研究較多的中藥，證明有降低血糖[18]、抗氧化作用[19]。研究發現，夜交藤對實驗性動脈粥樣硬化有一定的防治作用[20]。近年研究表明，甘草的有效成分對羥基自由基、超氧陰離子自由基和過氧化氫等均有明顯的清除作用及顯著的抗脂質過氧化作用；甘草酸能降低膽固醇含量和磷脂質，抑制機體和血管壁炎癥反應，防治動脈粥樣硬化進展[21]；甘草酸鹽可抑制血小板聚集；甘草黃酮類物質可防止低密度脂蛋白發生脂質過氧化反應[22]，由此可見甘草對血管病變有重要作用。賈彩霞等[23]研究復榮通脈膠囊對糖尿病大鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平及坐骨神經神經生長因子(NGF)表達的影響，證明復榮通脈膠囊具有拮抗氧化應激、促進神經再生作用。王慶凱等[24]研究發現，復榮通脈膠囊可降低可溶性血管內皮細胞蛋白C受體(sEPCR)和可溶性血栓調節蛋白(sTM)濃度，減輕內皮細胞損傷，有助于減少糖尿病大鼠心肌病的發生與發展。于文霞等[25]通過對164例糖尿病性周圍血管病變病人進行隨機對照研究，發現復榮通脈膠囊可明顯改善下肢供血，治療糖尿病性周圍血管病變療效確切。李倩等[26]報道，復榮通脈膠囊可明顯增加腎上腺素致微循環障礙小鼠耳郭微動脈及微靜脈管徑，加快微血管內紅細胞流速，改善小鼠耳郭微循環障礙；可明顯減輕實驗性大鼠動-靜脈旁路血栓形成；即復榮通脈膠囊可改善微循環，預防血栓形成。

綜上所述，既往實驗及臨床研究均提示復榮通脈膠囊對糖尿病大血管病變有明確治療作用，但其具體作用尚未完全闡明。本研究提示，復榮通脈膠囊對糖代謝無明顯影響，可抑制PAI-1、促進t-PA在動脈組織表達，從改善血管內皮舒縮功能、調節纖溶系統角度探討其抗動脈粥樣硬化機制，為復榮通脈膠囊治療糖尿病周圍血管病變提供理論依據。復榮通脈膠囊單藥組分可在不同層面發揮抗動脈硬化作用，但作為成藥是否有其他抗動脈硬化的機制尚需進一步研究。

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(本文編輯薛妮)

The Iufluence of Furong Tongmai Capsule on the Expressions of PAI-1 and t-PA in Thoracic Aorta Tissue of Diabetic Rats

Cui Ronggang,Tian Fengsheng,Su Yang,Bai Hailong,Bian Yun,Meng Xiaofeng

Cangzhou Clinical Medical School of Integrated Chinese and Western Medicine,Hebei Medical University,Cangzhou 061001,Hebei,China

Objective To observe the effects of Furong Tongmai capsule (FTC) on the expressions of plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1) and tissue plasminogen activator (t-PA) in thoracic aorta tissue of diabetic rats,and explore its possible mechanism.Methods Wistar rats were randomly chosen as blank control group and diabetes model group.The diabetic model rats were randomly divided into DM,FTC low-dose group,FTC medium-dose group,FTC high-dose group.Aftet 8 weeks later,we observed the blood sugar and the expression levels of PAI-1,t-PA with immunohistochemical technique.Results The blood sugar of diabetic rats was significantly higher than that in control group.The expression of PAI-1 in thoracic aortic was decreased in FTC medium-dose group and FTC high-dose group.The expression of t-PA in thoracic aortic was increased in FTC medium-dose group and FTC high-dose group.Conclusion FTC could improve the expression of t-PA,inhibit the over-expression of PAI-1 in thoracic aorta tissues of diabetic rats.

diabetic macroangiopathy；Furong Tongmai capsules；plasminogen activator inhibitor-1；tissue plasminogen activator

河北醫科大學附屬滄州中西醫結合臨床醫學院(河北滄州 061001)，E-mail：cuirgdujx1215@sina.com

引用信息：崔榮崗，田風勝，蘇陽，等.復榮通脈膠囊對糖尿病大鼠胸主動脈PAI-1、t-PA表達的影響[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2016，14(23)：2762-2766.

R587.1 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.23.013

1672-1349(2016)23-2762-05

2016-02-29)